[發明專利]一種提升巴氏醋桿菌吡咯喹啉醌含量的方法

有效

• 申請號: 202011147442.0
• 申請日: 2020-10-23
• 公開（公告）號: CN112251455B
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 周利南;韓程程;馮緯;劉曄;夏凱;梁新樂
• 申請（專利權）人: 浙江五味和食品有限公司;杭州市食品釀造有限公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;C12N15/113;C12J1/00;C12R1/02
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王靜

1.一種提升巴氏醋桿菌吡咯喹啉醌含量的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

步驟1）轉錄組測序及啟動子預測：

巴氏醋桿菌Ab3菌種活化，選取低酸壓力條件下和高酸壓力條件下表達水平差異較明顯的多個啟動子片段作為啟動子檢測和篩選的對象；

步驟2）質粒pBBRABT的構建：

連接紫色蛋白基因表達盒至質粒pBBRAB中構建質粒pBBRABT， 該質粒能在巴氏醋桿菌中穩定表達紫色蛋白，紫色蛋白表達盒序列如SEQ ID No.1所示，pBBRABT質粒序列如SEQID No.2所示；

步驟3）啟動子活性檢測和篩選

設計引物，利用PCR擴增步驟1）所述的巴氏醋桿菌Ab3，將PCR產物分別與pBBRABT質粒重組構建含有步驟1）所述的多個不同活性啟動子的紫色蛋白編碼基因表達盒，使用含有不同質粒的巴氏醋桿菌進行醋酸發酵實驗，根據紫色蛋白表達水平選擇最優的質粒；

步驟4）質粒pBBRABP的構建及PQQ合成量的提高

以Ab3基因組為模板，PCR擴增獲得PQQ合成基因簇pqqBCDE，引物序列如SEQ ID No.24-25所示，將擴增片段連入最優的質粒pBBRABT獲得質粒pBBRABP， 該質粒序列如SEQ IDNo.26所示；進一步，將該質粒導入巴氏醋桿菌Ab3中提高高酸壓力脅迫下PQQ的合成量。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，

所述步驟3)中，巴氏醋桿菌Ab3基因組作為模板用于PCR擴增，PCR擴增引物對分別如SEQ ID No .10/11，12/13，14/15，16/17，18/19，20/21，22/23所示。

對所獲得的不同DNA片段和質粒pBBRABT分別使用BamHI和EcoRI雙酶切后，使用片段純化試劑盒和割膠純化試劑盒進行純化；純化后的片段使用T4 DNA連接酶進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，進而獲得含有不同啟動子序列的紫色蛋白基因表達盒。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4）中，以Ab3基因組為模板，PCR擴增獲得PQQ合成基因簇pqqBCDE；PCR體系：正向引物序列如SEQ ID No.24，反向引物序列如SEQID No.25所示，擴增獲得的目的片段純化后分別用BamHI和XhoI 進行雙酶切，然后純化回收；質粒pBBRAB同樣使用BamHI和XhoI 進行雙酶切；純化后的目的片段和質粒片段在T4DNA 連接酶的作用下連接過夜，之后將連接產物轉化大腸桿菌DH5α；經過測序確認后將獲得的質粒pBBRABP導入巴氏醋桿菌Ab3。

4.一種提升高酸度食醋中PQQ含量的方法，其特征在于，該方法包括：將質粒pBBRABP導入巴氏醋桿菌Ab3中提高高酸壓力脅迫下PQQ的合成量，質粒pBBRABP的序列如SEQ IDNo.26所示。

5.一種用于提升高酸度食醋中PQQ含量的質粒，其特征在于，該質粒pBBRABP的序列為如SEQ ID No.26所示。

6.一種在食醋發酵過程中提高PQQ含量的巴氏醋桿菌，其特征在于，巴氏醋桿菌含有質粒pBBRABP，該質粒pBBRABP的序列如SEQ ID No.26所示。