[發明專利]一種毛細管96孔板的cDNA建庫方法

在審

• 申請號: 202011145150.3
• 申請日: 2020-10-23
• 公開（公告）號: CN112251491A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發明（設計）人: 劉少卿;曹振龍;高如霞;宋曉東
• 申請（專利權）人: 江蘇吉諾思美精準醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12M1/00;C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 南京中律知識產權代理事務所(普通合伙) 32341
• 代理人: 沈振濤

1.一種毛細管96孔板的cDNA建庫方法，其特征在于：包括以下步驟：

96孔板以橫向十二孔為工作流形成八條工作流，或以縱向八孔為工作流形成十二條工作流；每工作流取前七孔作為反應池，反應池依次為樣品池、cDNA第一鏈逆轉錄反應池、cDNA第二鏈逆轉錄反應池、酶切打斷與末端修復和加A反應池、接頭連接反應池、恒溫擴增反應池、擴增產物回收池；

樣品池的內含物為空，用于加樣；

cDNA第一鏈逆轉錄反應池的內含物為完成RNA逆轉錄成cDNA第一鏈反應的必要成分(buffer、酶mix、dNTP等)組成的反應混合物；

cDNA第二鏈逆轉錄反應池的內含物為完成RNA逆轉錄成cDNA第二鏈反應的必要成分(buffer、酶mix、dNTP等)組成的反應混合物；

酶切打斷與末端修復和加A反應池的內含物為完成文庫構建過程中cDNA酶切打斷與末端修復和加A反應的必要成分(buffer、酶mix、dNTP等)組成的反應混合物；

接頭連接反應池的內含物為完成文庫構建過程中連接接頭反應的必要成分(buffer、酶mix、文庫接頭等)組成的反應混合物；

恒溫擴增反應池的內含物為完成文庫構建過程中文庫擴增反應的必要成分(buffer、酶mix、index引物等)組成的反應混合物；

擴增產物回收池用于回收反應產物；

將反應物加入樣品池內，將蓋板蓋于孔板上，使電極置于反應池內，對反應池上的電極依次通電，利用毛細管電泳原理使樣品依次通過樣品池、cDNA第一鏈逆轉錄反應池、cDNA第二鏈逆轉錄反應池、酶切打斷與末端修復和加A反應池、接頭連接反應池、恒溫擴增反應池、擴增產物回收池，從而獲得cDNA文庫。

2.根據權利要求1所述一種毛細管96孔板的CDNA建庫方法，其特征在于：樣品池的最大加樣體積為200μL；加入的樣品類型為抽提后的RNA。

3.根據權利要求1所述一種毛細管96孔板的CDNA建庫方法，其特征在于：擴增方式采用恒溫PCR的方式進行文庫擴增。

4.一種用于CDNA建庫的毛細管96孔板，其特征在于：包括孔板(1)、蓋板(2)、注膠孔(3)、毛細管(4)、反應孔(5)、電極(6)；所述孔板(1)上間隔地設置有多組反應孔(5)；同一橫排方向的反應孔(5)通過橫向毛細管(4)連通，橫向毛細管(4)通過豎向毛細管(8)連通；所述注膠孔(3)固定安裝在豎向毛細管(8)的通路上；所述蓋板(2)活動蓋設在孔板(1)上表面，蓋板(2)側面固定安裝有多組電極(6)，其中，當孔板(1)和蓋板(2)相對時，蓋板(2)上每組電極(6)放置于孔板(1)上反應孔(5)內；孔板(1)上還包括多組輔助電極孔(7)，每組單獨地固定安裝在孔板(1)的端部一側，每一組均與豎向毛細管(8)相連通。

5.根據權利要求1所述孔板內毛細連續反應裝置，其特征在于：所述孔板(1)上的反應孔(5)在排布結構上設置為96孔板結構，其中十二組橫排，一排八組反應孔。

6.一種用于CDNA建庫的毛細管96孔板，其特征在于：

所述96孔板以橫向十二孔為工作流形成八條工作流，或以縱向八孔為工作流形成十二條工作流；每工作流取前五孔作為反應池，反應池依次為樣品池、cDNA第一鏈逆轉錄反應池、cDNA第二鏈逆轉錄反應池、酶切打斷與末端修復和加A反應池、接頭連接反應池、恒溫擴增反應池、擴增產物回收池；

樣品池的內含物為空，用于加樣；

cDNA第一鏈逆轉錄反應池的內含物為完成RNA逆轉錄成cDNA第一鏈反應的必要成分(buffer、酶mix、dNTP等)組成的反應混合物；

cDNA第二鏈逆轉錄反應池的內含物為完成RNA逆轉錄成cDNA第二鏈反應的必要成分(buffer、酶mix、dNTP等)組成的反應混合物；

酶切打斷與末端修復和加A反應池的內含物為完成文庫構建過程中cDNA酶切打斷與末端修復和加A反應的必要成分(buffer、酶mix、dNTP等)組成的反應混合物；

接頭連接反應池的內含物為完成文庫構建過程中連接接頭反應的必要成分(buffer、酶mix、文庫接頭等)組成的反應混合物；

恒溫擴增反應池的內含物為完成文庫構建過程中文庫擴增反應的必要成分(buffer、酶mix、index引物等)組成的反應混合物；

擴增產物回收池用于回收反應產物。