[發(fā)明專利]一種TZAP基因或蛋白作為提高間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化能力的靶點中的應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011140214.0
• 申請日: 2020-10-22
• 公開（公告）號: CN112251465A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 別亞男;謝水林;肖政
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州華騰生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/12;C12N5/10
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 潘穎

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種TZAP基因或蛋白作為提高間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化能力的靶點中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)敲除TZAP基因后，MSCs的增殖、分化能力明顯升高，衰老細(xì)胞數(shù)明顯減少；發(fā)現(xiàn)了TZAP對MSCs的增殖、自我更新和分化中發(fā)揮積極作用。本發(fā)明首次揭示了TZAP基因?qū)SCs的干性及及其成骨成脂分化的影響，為間充質(zhì)干細(xì)胞大量體外擴增并維持其干性及應(yīng)用提供新的方案，為間充質(zhì)干細(xì)胞大量體外擴增并維持其干性及在骨相關(guān)疾病治療方面的應(yīng)用提供新的方案，具有很大的應(yīng)用價值和前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種TZAP基因或蛋白作為提高間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化能力的靶點中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一種多能干細(xì)胞，它具有干細(xì)胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。在臨床應(yīng)用也最多，與造血干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。當(dāng)患者接受大劑量化療后，將間充質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞一同輸入，可明顯加速患者血細(xì)胞恢復(fù)時間，且安全無不良反應(yīng)。間充質(zhì)干細(xì)胞不僅存在于骨髓中，也存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。由于它分化的組織類型十分廣泛，因此臨床應(yīng)用價值不菲。

MSCs移植具有諸多優(yōu)點，如免疫排斥輕、來源廣泛等，但MSCs移植尚面臨諸多難題：

1)體內(nèi)安全性有待評估。體外擴增的MSCs移植后在體內(nèi)長期存在是否有致瘤風(fēng)險目前仍未可知。

2)MSCs體外活性的維持。體外培養(yǎng)條件下如何更好地維持MSCs的干性目前尚無確切答案。

3)MSCs移植后遷移與分化。

如何促進(jìn)移植的MSCs在體內(nèi)的分化率和存活率并向目標(biāo)區(qū)域遷移，如何把握MSCs移植的合適時間和數(shù)量，如何促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞的分化，也是亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種TZAP基因或蛋白作為提高間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化能力的靶點中的應(yīng)用。敲除TZAP基因后，MSCs的增殖、分化能力明顯升高。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種TZAP基因或蛋白作為間充質(zhì)干細(xì)胞干性標(biāo)志物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種TZAP基因或蛋白作為提高間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化能力的靶點中的應(yīng)用。

本發(fā)明中使用Cas9和sgRNA整合一起的lentiCRISORv2質(zhì)粒，應(yīng)用CRISP/Cas9技術(shù)，通過設(shè)計靶向TZAP的sgRNA進(jìn)行敲除，將構(gòu)建好的lentiCRISPRv2-TZAP慢病毒載體與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，獲得敲除慢病毒。用嘌呤霉素篩選慢病毒感染過人MSCs，通過qPCR及westemblot檢測成功構(gòu)建TZAP敲除細(xì)胞系。

發(fā)明人應(yīng)用CRISP/Cas9技術(shù)建立TZAP敲除人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系，觀察其增殖、自我更新和分化能力。首先評估了所設(shè)計的Cas9的敲除效率，基因組測序、實時定量PCR和免疫印記結(jié)果顯示，敲除TZAP的MSCs的mRNA水平和蛋白水平，與對照相比，差異有顯著性(P＜0.05)。并且，TZAP基因敲除的MSCs的增殖率(BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量及CCK8實驗OD值)顯著高于對照組，這些結(jié)果表明TZAP在MSCs的增殖和生長中起著重要的促進(jìn)作用。

進(jìn)一步了解TZAP對MSCs分化能力的作用，進(jìn)行了MSCs分化的實驗，TZAP敲除組與TZAP未敲除的對照組相比，成骨分化及成脂分化細(xì)胞數(shù)明顯增加(茜素紅染色及油紅O染色陽性細(xì)胞數(shù)增多)，并且成骨標(biāo)志物(Alp，Runx2和andCol1a1)脂肪分化標(biāo)志物(Cebpa)的mRNA的表達(dá)水平表達(dá)量明顯升高，表明MSCs的分化能力均顯著升高。且敲除TZAP的MSCs衰老細(xì)胞數(shù)明顯減少(β-gal染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少)。這些數(shù)據(jù)表明，TZAP在調(diào)控MSCs的增殖及分化中發(fā)揮重要作用。