[發明專利]基因重組細胞穿膜肽RTP及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202011138826.6
• 申請日: 2020-10-22
• 公開（公告）號: CN112457370B
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發明（設計）人: 馬義
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C12N15/11;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C07K1/22;C07K1/16;C07K1/14;A61K8/64;A61Q19/00;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗

1.一種基因重組細胞穿膜肽RTP，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.編碼權利要求1所述的基因重組細胞穿膜肽RTP的核苷酸序列。

3.根據權利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于：編碼所述的基因重組細胞穿膜肽RTP的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一種基因重組細胞穿膜肽RTP的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)設計并合成RTP基因：

采用一對互補引物PCR反應合成RTP基因：

引物1：

引物2：

GGTACC為KpnI酶切位點，CTCGAG為XhoI酶切位點；

(2)構建重組載體pET32a-RTP：

用KpnI酶和XhoI酶分別對質粒pET32a和步驟(1)制得的RTP基因進行雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接雙酶切后的RTP基因和雙酶切后的質粒pET32a，得到重組質粒pET32a-RTP；

(3)制備表達工程菌pET32a-RTP/BL21(DE3)：

用重組質粒pET32a-RTP轉化表達宿主大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，得到表達工程菌pET32a-RTP/BL21(DE3)；

(4)表達和純化：

①誘導表達工程菌pET32a-RTP/BL21(DE3)表達由Trx標簽蛋白、His標簽蛋白和細胞穿膜肽RTP組成的融合蛋白；

②表達的帶His標簽的融合蛋白用鎳柱進行純化：在蛋白上樣后，帶有His標簽的融合蛋白特異性結合鎳柱，其他的雜蛋白因不能特異性結合鎳柱而流出；用咪唑梯度洗脫，因咪唑與Ni²⁺結合能競爭性結合鎳柱，進而釋放融合蛋白，收集洗脫液；

③融合蛋白的酶切及細胞穿膜肽RTP的純化；

④利用高效液相色譜技術純化制備細胞穿膜肽RTP，得到高純度基因重組細胞穿膜肽RTP。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：

步驟(1)中所述的PCR反應的條件為：95℃，5min；95℃，1min；56℃，1min；72℃，1min；30個循環；72℃，10min。

6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：

步驟(4)②純化所用的平衡緩沖液、洗滌緩沖液的組成如下：

Lysis平衡緩沖液：50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，pH＝8.0；

洗滌緩沖液：50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，10～50mM咪唑，pH＝8.0；

步驟(4)②中，洗脫鎳柱的溶液的組成如下：50mM Na₂HPO₄，0.3M NaCl，250mM咪唑，pH＝8.0。

7.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于：

步驟(4)③中所述融合蛋白的酶切及細胞穿膜肽RTP的純化步驟如下：

1)將融合蛋白洗脫液置于pH 7.6的1×PBS緩沖液中透析，透析后融合蛋白溶液加入腸激酶，加入量為每500μg融合蛋白加入5U腸激酶，酶切條件是：25℃條件下酶切6h；

2)將酶切后的溶液體系過平衡好的Ni-NTA純化柱，收集穿透液，用含250mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫柱子上的標簽結合蛋白和其他結合雜蛋白，洗脫總體積為柱床的5倍，再生Ni-NTA純化柱；收集的穿透液即為含有細胞穿膜肽RTP的初步純化產物。