[發明專利]一種霍山石斛根尖標本片及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202011136719.X
• 申請日: 2020-10-22
• 公開（公告）號: CN112255069A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發明（設計）人: 向增旭;張成才
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N1/28;G01N1/34
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 蘇士瑩

本發明提供了一種霍山石斛根尖標本片及其制備方法和應用，涉及玻片制備技術領域。本發明所述制備方法對常規的壓片法進行改進，尤其是冷水預處理24h以上，0～4℃環境中利用卡諾試劑固定24h，青霉素試管中解離，染色10min后制片并觀察。本發明所述制備方法，解離時間短，解離效果好，能清晰的將根尖分生組織區域分離出來；染色體分離效果好，穩定性、可重復性高、分裂像多；并且所用化學試劑屬于環境友好型試劑。利用所述制備方法制備得到的標本片，可以在顯微鏡下準確鑒定霍山石斛二倍體和四倍體染色體，為霍山石斛多倍體育種及技術克隆提供技術支持。

技術領域

本發明屬于玻片制備技術領域，具體涉及一種霍山石斛根尖標本片及其制備方法和應用。

背景技術

霍山石斛(Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng)為蘭科石斛屬多年生草本植物，為中國特有種，又稱“米斛”，主產于安徽大別山地區。霍山石斛具有調和陰陽、壯陽補腎和益氣除熱之功能，其藥用、食用歷史悠久。研究表明，霍山石斛含有多糖類、生物堿類和黃酮類等成分，具有提高人體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、降血糖和修復肝損傷等功效。自然界的霍山石斛多為二倍體，與二倍體植物相比，同源四倍體植株個體更大，活性成分含量較高。自然界中霍山石斛二倍體染色體數目為2n＝2x＝38，同源四倍體染色體數目為2n＝4x＝76。染色體是遺傳物質在肉眼可見層面的載體和物質基礎，通過對霍山石斛的染色體的研究，為霍山石斛多倍體育種提供可靠的依據，為探索植物遺傳多樣性、豐富植物基因庫奠定基礎。

染色體計數法是目前確定植物染色體倍性最直接、最準確的方法，通過觀察霍山石斛試管苗染色體，可以從細胞學水平上直接對霍山石斛二倍體與四倍體試管苗進行鑒定，也可以在染色體水平上為霍山石斛品種的起源演化以及分類研究提供重要的細胞學依據。現有的染色體鑒定方法步驟較為繁瑣，使用的化學試劑對環境不友好，染色體細胞被化學試劑破環，根尖細胞染色體細胞膜的破環導致染色體出現較多嵌合體，不容易觀察，從而鑒定成功率低，鑒定結果差。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種霍山石斛根尖標本片及其制備方法和應用，利用霍山石斛根尖標本片進行染色體鑒定時，能準確鑒定霍山石斛二倍體和四倍體染色體，為霍山石斛多倍體育種及技術克隆提供技術支持。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種霍山石斛根尖標本片的制備方法，包括以下步驟：(1)取霍山石斛苗長3～5mm的根，沖洗后浸入蒸餾水中，0～4℃環境中處理至少24h，得預處理根；

(2)將預處理根投入卡諾固定液中，于0～4℃環境中固定24h；

(3)將固定后的根尖置于含有青霉素的試管內，蒸餾水清洗，利用1mol/L的HCl水溶液解離，所述解離的溫度為60℃，所述解離的時間為6～8min；

(4)切取解離后的根尖上0.8～1.2mm的根尖生長區，利用醋酸洋紅染色劑或改良苯酚品紅染色液染色10min，蓋上蓋玻片，壓片，得標本片。

優選的，步驟(1)所述根在早晨8:00～9:00切取。

優選的，步驟(1)所述根為培養的36h齡的霍山石斛試管苗根尖。

優選的，經步驟(2)所述固定后，若不及時使用固定后的根尖，將所述固定后的根尖依次經體積百分含量為90％的酒精水溶液和70％的酒精水溶液各浸洗一次，再置于新的體積百分含量為70％的酒精水溶液中，放置在0～4℃環境中保存。

優選的，經所述保存后的根尖材料在使用前，可用所述固定液再處理一次，所述再處理的時間為6～8h。

優選的，步驟(3)所述解離后還包括清水沖洗2～3次。