[發明專利]一種亞細胞定位表達載體及構建方法

在審

• 申請號: 202011135875.4
• 申請日: 2020-10-22
• 公開（公告）號: CN112266925A
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 丁照華;程文;王志武;唐媛;崔海燕;趙蘇嫻;盧增斌
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院玉米研究所（山東省農業科學院玉米工程技術研究中心）
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 濟南尚本知識產權代理事務所(普通合伙) 37307
• 代理人: 楊寶根

本發明屬于基因工程技術領域，公開了一種亞細胞定位表達載體及構建方法，在TA載體中獲得ccdB毒性蛋白，同時利用PCR在Gateway載體p2FGW7中擴增得到eGFP片段，在pCambia載體中獲得多克隆位點以及載體的骨架，獲得P35s∷ccdB?eGFP片段。用多克隆位點進行酶切后，所獲得的線性片段中不再含有ccdB蛋白，同時獲得黏性末端，可以利用連接酶將含有相應黏性末端的目的片段插入到載體中。本發明的亞細胞定位載體既可以用于瞬時轉化，研究亞細胞定位，也可以利用農桿菌介導的方法，獲得穩定的轉基因植株；獲得的轉基因材料可以用于下一步的生理生化與功能分析。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種亞細胞定位表達載體及構建方法。

背景技術

目前，最接近的現有技術：

近年來，隨著植物全基因組測序的快速發展，一大批植物物種完成了參考序列的拼接、組裝和注釋。對基因進行解析并明確其功能已成為我們了解生命密碼的必需步驟。目前植物科學研究中，功能基因研究離不開載體的構建。

目前常用的載體構建方法有Gateway系統的同源重組法、胡向陽研究組開發的TA克隆法以及pCambia系列載體。Gateway系列載體利用載體上面的attR和attL序列，通過同源重組酶，將片段插入到載體中，采用毒性蛋白ccdB和相應的抗生素進行篩選；胡向陽團隊開發的TA克隆系列載體，利用非高保真酶擴增得到的PCR產物末端含有突出的堿基A的特點，利用限制性內切酶XcmI切割載體，產生突出的堿基T，然后利用堿基A∷T配對的方式將目的片段插入到載體中。

上述兩種方法都極好的利用了毒性蛋白ccdB，以及相應抗生素篩選的方法，所產生的片段均為零背景的目的克隆。但目前同源重組酶的價格相對較高，TA克隆則存在連接效率較低的情況。pCambia系列載體采用的是限制性內切酶連接的方式將目的基因插入到載體中，連接效率高，該方法目前實驗中采用的較多。但該系列的載體不含有毒性蛋白，僅采用相應抗生素進行篩選，得到的克隆中，時常存在假陽性，即不能排除空載的情況。

綜上所述，現有技術存在的問題是：

（1）目前同源重組酶的價格相對較高，TA克隆則存在連接效率較低的情況。

（2）pCambia系列載體不含有毒性蛋白，僅采用相應抗生素進行篩選，得到的克隆中，時常存在假陽性，即不能排除空載的情況。

解決上述技術問題的意義：

本發明將ccdB毒性蛋白與限制性內切酶位點進行聚合，構建出既含有多個限制性內切酶位點，又含有ccdB毒性蛋白篩選的亞細胞定位載體。該載體既可以用于瞬時轉化，研究亞細胞定位，也可以利用農桿菌介導的方法，獲得穩定的轉基因植株。獲得的轉基因材料可以用于下一步的生理生化與功能分析。

本發明加快和簡化了載體構建的速度，方便基因功能的研究。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供了一種亞細胞定位表達載體的構建方法。

本發明是這樣實現的，一種亞細胞定位表達載體的構建方法，所述亞細胞定位表達載體的構建包括以下步驟：

（1）從TA載體（參考文獻Wang, C., et al. (2013). A series of TA-based andzero-background vectors for plant functional genomics）中獲得ccdB毒性蛋白，同時利用PCR在Gateway載體p2FGW7中擴增得到eGFP片段，在pCambia載體中獲得多克隆位點以及載體的骨架，獲得P35s∷ccdB-eGFP片段。

（2）用多克隆位點進行酶切后，所獲得的線性片段中不再含有ccdB蛋白，同時獲得黏性末端，可以利用連接酶將含有相應黏性末端的目的片段插入到載體中。