[發明專利]一種小鼠ACE2基因真核表達質粒pVAX1-ACE2的構建

在審

• 申請號: 202011135194.8
• 申請日: 2020-10-21
• 公開（公告）號: CN112301053A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 閆書平;張源淑;王換換;謝娜娜;朱斌;付亞麗
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65;C12N9/48;C12N15/57;C12N15/66
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本發明提供了小鼠ACE2基因真核表達質粒pVAX1?ACE2。提供了ACE2基因過表達質粒，構建了ACE2真核表達載體，并對其進行細胞驗證。驗證后的過表達載體，能穩定存在小鼠乳腺上皮細胞中，且過量表達ACE2蛋白，為后續其在乳腺炎發生發展中的治療作用奠定基礎。ACE2自發現以來，對其多種功能進行了研究，ACE2作為一種強有力的負調節分子，平衡ACE的多種功能，通過靶向降解AngII，在全身各器官中表現出了保護性的作用；其次，作為SARS冠狀病毒的必要受體，下調ACE2能夠誘發嚴重的肺衰竭；ACE2和它的同源物Collectrin都同氨基酸轉運載體相聯系，分別在腎臟和腸道氨基酸吸收中起重要的作用。所以本發明無論是從基礎研究還是臨床運用上的意義都是十分重大。

技術領域

本發明屬于分子克隆技術領域，具體涉及一種小鼠ACE2(Angiotensinconverting enzyme 2)基因的克隆，真核載體的連接及過表達載體在乳腺上皮細胞中的驗證。

背景技術

血管緊張素轉化酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是2000年發現的一種多效單羧肽酶，從2000年至今的研究已證實：ACE2在體內廣泛分布，主要分布在心臟、腎臟、睪丸、肺、肝臟、消化道、腦等器官組織，并且證實其介導的ACE2-Ang1-7-Mas通路在正常的心臟、肝臟、腎臟等組織中表達量較低，更多地參與了許多特殊生理或病理情況下的調節，不僅在高血壓和心血管疾病方面發揮著重要作用，還參與了肝、腎、肺、腸道等局部組織的抗炎癥、抗氧化應激、抗纖維化等的損傷和抗損傷過程。

研究中，常添加ACE2活性蛋白來治療腸道炎癥和乳腺炎癥，但活性蛋白價格過高，制備過程較為復雜，故研究人員一般通過構建重組質粒來達到過量表達ACE2的作用，一般選用真核載體pcDNA3.1，本研究中選用真核載體pVAX1。pVAX1是在載體pcDNA3.1的基礎上改建而成的一種新型真核表達載體，大小為3.0kb。該質粒用卡那霉素抗性篩選基因替代pcDNA3.1中的氨卞霉素抗性篩選基因，最大程度地減少抗性篩選基因和小鼠基因組發生重組的可能性。pVAX1含有多個克隆酶切位點允許同時克隆多個大片段的目的基因，強啟動子pCMV和BGH poly A信號可以在哺乳動物細胞中高水平表達重組蛋白。

在本發明研究中，根據NCBI公布的小鼠ACE2序列(NM_001130513.1)，通過PCR擴增得到了小鼠的ACE2基因，利用真核表達系統表達了pVAX1-ACE2重組質粒，通過將重組質粒pVAX1-ACE2轉入乳腺上皮細胞，通過Western blot技術檢測ACE2蛋白表達量鑒定該重組質粒。本發明研究有望用于治療小鼠乳腺炎癥，為小鼠乳房炎的研究提供了基礎資料。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的是根據ACE2作為RAS系統的負調節分子，通過靶向降解AngII，發揮抗損傷、抗纖維化等機體保護功能；作為急性嚴重呼吸系統綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)主要功能性受體，具有保護肺損傷的功能；協同氨基酸轉運載體轉運，與氨基酸吸收不良、腸道微生態平衡和胃腸道炎癥乳腺炎癥中所發揮著關鍵作用，本研究通過構建過表達質粒pVAX1-ACE2來治療乳腺炎癥，不僅在經費上節約了成本，還為ACE2在小鼠乳房炎研究方面的研究提供基礎資料。

為實現上述目的，本發明采用以下的技術方案為：

一種小鼠的ACE2克隆載體或過表達載體的制備方法，其包括以下步驟：

S1、選取小鼠腎臟組織，經生理鹽水漂洗后迅速放入液氮速凍。提取組織RNA，使用隨機引物將RNA反轉錄為cDNA。提取組織RNA，使用隨機引物將RNA反轉錄為cDNA。設計ACE2的上下游引物用于ACE2全長基因擴增，并在ACE2基因片段兩側分別加入BamHI和Xho1兩個酶切位點，以cDNA為模板，擴增獲得ACE2基因全長，擴增條件為：95℃，3min→95℃，15s→66℃，15s→72℃，1min 50s→72℃，5min；35個循環。