[發明專利]CDC20突變引發卵子成熟障礙的卵子功能恢復制劑及其使用方法

在審

• 申請號: 202011133956.0
• 申請日: 2020-10-21
• 公開（公告）號: CN112359062A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 王磊;匡延平;桑慶
• 申請（專利權）人: 復旦大學;珠海復旦創新研究院
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66;C12N15/12;C12N15/10;C07K14/47;C12N5/075;C12N5/073
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

1. 一種CDC20基因突變引發卵子成熟障礙的卵子功能恢復制劑，其特征在于，該制劑由一定濃度CDC20cRNA或CDC20蛋白質配制而成，所述CDC20基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述的CDC20蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；CDC20cRNA的濃度為300-1000ng/ul；CDC20蛋白質的濃度為0.5-1mg/ml。

2.一種如如權利要求1所述制劑的制備方法，其特征在于，具體步驟為：

（1）CDC20cRNA制劑制備：以CDC20基因cDNA為模板通過PCR擴增CDC20的編碼區，純化PCR產物并以此為模板經過SfaAI 和MluI雙酶切后構入載體pCMV6，用AgeI將載體單酶切，體外轉錄成CDC20的cRNA，并將其濃度稀釋到300-1000ng/ul；其中：

CDC20cRNA制劑制備PCR擴增引物對為：

hCDC20-SfaAI-F: CCGCGATCGCATGGCACAGTTCGCGTTCGAGAGT，

hCDC20-TGA-MluI-R: GTACGCGTTCAGCGGATGCCTTGGTGGATGAGG；

（2）CDC20蛋白質制劑制備：以CDC20基因cDNA為模板通過PCR擴增CDC20的編碼區，純化PCR產物并以此為模板經過BamHI 和XhoI雙酶切后構入載體pFast-Bac1，轉化DH10BacE.coli，通過藍白斑篩選挑出陽性克隆并測序驗證；Bacmid轉染Sf9昆蟲細胞，獲得P1代和P2代病毒；P2代病毒繼續感染Sf9細胞，感染48-72小時收集細胞；超聲破碎，超速離心取上清；經純化后獲得目的蛋白，調整濃度為0.5-1mg/ml；其中：

CDC20蛋白質制劑制備PCR擴增引物對為：

hCDC20-BamHI-F: CGGATCCGATGGCACAGTTCGCGTTCGAGAGT，

hCDC20-TGA-XhoI-R: GCGCTCGAGTCAGCGGATGCCTTGGTGGATGAGG。

3.一種如權利要求1所述制劑的使用方法，其特征在于，具體步驟為：

（1）對于取出的患者卵子，將顆粒細胞消化掉，選擇MI/MII期卵子，首先進行CDC20cRNA制劑或CDC20蛋白質制劑注射，注射濃度：CDC20 cRNA為300-1000ng/ul，CDC20蛋白質制劑為0.5-1mg/ml，注射體積為5-15pL，10小時后待排出第一極體完成成熟過程再進行卵漿內單精子注射（ICSI），15-18h后觀察雌雄原核形成；

（2）形成原核的受精卵培養觀察到第5-6天，將發育正常的囊胚活檢同時凍存，染色體正常的囊胚將用于將來移植。