[發明專利]一種鑒定西瓜雜交種純度的SNP位點、引物組及應用

有效

• 申請號: 202011133306.6
• 申請日: 2020-10-21
• 公開（公告）號: CN112195263B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 溫常龍;張建;楊靜靜;張曉飛;羅江;李向晶
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京五洲洋和知識產權代理事務所(普通合伙) 11387
• 代理人: 劉春成;榮紅穎

本發明公開了一種鑒定西瓜雜交種純度的方法及其使用的SNP引物組合。本發明所提供的SNP引物組合由8個引物組組成；每個引物組由3條引物序列組成，用于擴增一個SNP位點；各個引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：24所示。該SNP引物組合可在西瓜雜交種的種子或幼苗期進行早期鑒定，保證雜交種的純度，切實保護生產者和育種家的權益，并為西瓜品種的種子質量管理提供技術支持。本發明提供的方法具有高通量、準確、低成本、操作簡單、節約人力、物力等有點，具有十分廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于分子標記及其檢測領域，具體涉及一種鑒定西瓜雜交種純度的SNP位點、引物組、試劑盒、檢測方法及應用。

背景技術

西瓜(Citrullus lanatus)原產非洲地區，屬于葫蘆科西瓜屬一年生蔓生草本植物，其果實味甜多汁、富含多種營養成分，在熱帶、亞熱帶地區廣泛栽培。我國是西瓜的生產大國和消費大國，自20世紀80年代西瓜雜交一代品種在我國普及推廣以來，西瓜栽培面積迅速擴大，用種量和相應品種也越來越多。目前，全國通過鑒定、認定、登記的西瓜品種達1100多個，而在市場上的銷售的西瓜品種數量遠超這一數字。但在售西瓜種子質量參差不齊，其中一個較為突出的問題就是種子純度不達標，這給之后西瓜生產造成了嚴重損失。傳統種子純度鑒定主要通過種子形態鑒定、田間表型鑒定等，周期長且費工費時，同時受主觀和環境因素影響較大，準確性難以保證。

依據農作物種子質量標準(GB16715.3--2010)的規定，西瓜三倍體雜交種二倍體雜交種和西瓜三倍體雜交種的純度不低于95％。而國際上一流的西瓜種業公司因其嚴格的質量管理和純度鑒定體系，其要求上市的種子純度接近100％。因此，盡快開展純度鑒定是種子上市前的必然要求，同時純度鑒定結果也是種子生產質量控制和交易的重要依據。

常用的種子純度鑒定方法有形態學鑒定和分子鑒定。傳統的形態學鑒定易受環境、氣候和人為因素的影響，且存在費時費地費力等缺點。利用分子標記技術能夠從DNA水平上檢測雜交種和親本之間的差異，克服了空間的限制，極大縮短了檢驗所需時間。同時值得注意的是，根據《非主要農作物品種登記指南》的要求，品種特性說明和品種DUS測試報告中涉及的有關性狀如有明確關聯基因，可以直接提交DNA檢測結果。因此，基于DNA水平的分子標記檢測鑒定種子純度是快速和可靠的，是西瓜種業檢測的發展趨勢所在。

目前品種純度鑒定可用的分子標記有RAPD標記、SRAP標記、SSR標記等，尤其SSR標記在純度鑒定方面較為常用。如利用SSR引物對京欣1號、京欣2號、京欣3號、京欣無籽1號、京秀、暑寶和航興天秀1號進行的純度鑒定(牛茜等，2014)；對上海農科院的5個西瓜品種：申選958、雙色冰淇淋、黃晶、圣女紅3號進行種子純度的鑒定(李超漢等，2015)；對天津市靜海區主要種植的8424類型西瓜品種蜜多進行的純度鑒定(焦荻等，2019)等。國內技術專利方面，如申請號為CN201410788486.X，于2016年9月28日公告的專利，其找到了SSR引物QYXG3或QYXG7，利用此引物刻對西瓜雜交品種荃抗綠霸進行純度鑒定。CN201510136245.1，于2017年10月31日公告的專利，其找到了一對SSR引物可用于西瓜品種紅和平雜交種的純度鑒定。申請號為CN201610616215.5，于2019年12月3日公告的專利，其利用SSR和Indel標記組合，采用雙重PCR技術對小型西瓜品種瓊麗的純度進行鑒定，提高了檢測準確性。其他還包括其他一系列已公開專利中使用SSR引物對博琳、安德、天福二號、黃鳳凰、安然、豐華21雜交種子純度鑒定和使用RAPD引物對蘇蜜6號、蘇蜜9號進行純度鑒定的方法等。這些技術簡單易行、快速準確、費用低，具有應用價值。

但目前已報道或公開的技術和相關引物，其可應用的品種仍然較少，最多的只有7個品種。這遠遠達不到我國當前西瓜市場銷售品種的種子純度鑒定要求。另外受限于SSR檢測方式，其檢測時極易導致不真實、假陽性、假陰性的結果，因此不能適應自動化、高通量、大規模的檢測時對準確性和穩定性的要求。