[發明專利]一種用于黃鱔生殖干細胞的分離方法及培養基

有效

• 申請號: 202011132466.9
• 申請日: 2020-10-21
• 公開（公告）號: CN112251399B
• 公開（公告）日: 2022-12-09
• 發明（設計）人: 孫玉華;孫曉云;王永鑫
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075;C12N5/076
• 代理公司: 武漢大楚知識產權代理事務所(普通合伙) 42257
• 代理人: 徐楊松

本發明涉及一種用于黃鱔生殖干細胞的培養基，包括基礎培養基和FBS，所述FBS的濃度為5?8％；還涉及一種用于分離培養黃鱔生殖干細胞的方法，包括使用上述所述的培養基培養所述黃鱔生殖干細胞的步驟。本發明的培養基可提高黃鱔生殖干細胞的貼壁效率，防止黃鱔生殖干細胞分化，不影響黃鱔生殖干細胞的增殖功能。通過本發明的方法，可使用黃鱔的性腺組織在5天內分離獲得純度較高的黃鱔雌性生殖干細胞和雄性生殖干細胞。得到的生殖干細胞具有典型的干細胞形態，可形成典型的干細胞克隆，堿性磷酸酶染色呈陽性，干細胞相關分子標記也高表達。在將本發明的方法獲得的生殖干細胞凍存后，可成功復蘇。

技術領域

本發明涉及經濟魚類育種領域，更特別地，涉及一種用于黃鱔生殖干細胞的分離方法及培養基。

背景技術

生殖干細胞是在動物的種系維持中唯一能將遺傳物質傳遞給后代的種子細胞，具有我更新功能和分化多能性。生殖干細胞的研究對動物遺傳育種、珍惜物種保護至關重要。

生殖干細胞的分離、誘導分化及相關操作技術成為干細胞研究領域的熱點。魚類干細胞的研究工作起步雖然較晚，但是已經有了長足。目前，國內外學者已經成功建立了多個魚類的胚胎干細胞系和生殖干細胞系。體外培養獲得的虹鱒和青鱂PGC，能夠在同源受體性腺移植并成功發育。隨后，又建立了一些國內外主要水產經濟魚類的種內和種間生殖細胞的移植技術。這項技術的突破使魚類的“借腹生子”成為可能。

黃鱔作為我國重要的經濟食用魚類，野生黃鱔被大量毀滅性捕撈，數量日漸減少。因其特殊的生活方式和產卵習性，黃鱔面臨著種質資源衰退和優良苗種短缺的嚴峻問題。傳統的黃鱔育種又是一個極其緩慢的過程，因此，如何獲得大量優質的黃鱔種苗一直是目前科研工作者亟待解決的問題。肖亞梅等嘗試通過分離組織塊的方法，培養黃鱔成體性腺組織干細胞，但是該方法培養周期長，且獲得的生殖干細胞是一種混合型的細胞。

因此，如何通過優化分離方法和培養體系，建立較為完善的黃鱔類生殖細胞培養體系，是本領域亟待解決的技術難點。

發明內容

為解決以上問題，本發明提供了一種用于黃鱔生殖干細胞的培養基，包括基礎培養基和FBS，所述FBS的濃度為5-8％。使用該濃度的FBS可提高黃鱔生殖干細胞的貼壁后的增殖能力，防止黃鱔生殖干細胞分化，不影響黃鱔生殖干細胞的增殖功能。

在一個具體實施方案中，所述基礎培養基為RPMI 1640和/或DMEM/F12。盡管本發明在實施例中列舉了RPMI 1640為例子對本發明的原理和效果進行展示，但是實現本發明使用的基礎培養基還可以用其他培養基，例如DMEM/F12等，只要滿足干細胞的基本培養要求即可。在我們的研究中使用DMEM/F12替代RPMI 1640，得到了類似的結果。

在一個優選實施方案中，所述培養基還包括1-5％的KSR和/或1-5％的黃鱔血清。培養基中添加了KSR和黃鱔血清后，有利于多能干細胞干性的維持，生殖干細胞具有更快的增殖速度，并且呈現典型的干細胞形態。

在一個優選實施方案中，所述培養基還包括生長因子。

優選地，所述生長因子為bFGF和/或EGF。bFGF的濃度可為5-15ng/ml，EGF的濃度可為10-30ng/ml。通過添加生長因子，可促進細胞增殖。

在一個優選實施方案中，所述培養基還包括緩沖劑、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺和β-巰基乙醇中的一種或多種組合。

在一個具體實施方案中，所述培養基中含有0.5-2mM丙酮酸鈉，1-4mM L-谷氨酰胺，10-100μMβ-巰基乙醇，10-20mM Hepes。