[發(fā)明專利]擬南芥葉綠素b合成基因CAO在番茄中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011131931.7
• 申請(qǐng)日: 2020-10-21
• 公開（公告）號(hào): CN112251417A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈婷;胡學(xué)運(yùn);伊姆蘭;程宇婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02;C12N15/53;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82;C12Q1/6895
• 代理公司: 揚(yáng)州蘇中專利事務(wù)所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

1.一種擬南芥葉綠素b合成基因CAO在番茄中的應(yīng)用，其特征是，包括以下步驟：

(1)克隆目標(biāo)基因序列并構(gòu)建質(zhì)粒；分別克隆擬南芥中AtCAO基因的BC區(qū)域的序列、標(biāo)簽多肽FLAG的基因序列，將BC區(qū)域的序列與FLAG連接形成1個(gè)融合的基因片段BC-FLAG；構(gòu)建p35S:BC-FLAG質(zhì)粒，在番茄中轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)BC-FLAG；

(2)檢測(cè)番茄中AtCAO的表達(dá)；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄，并在相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上篩選并獲得轉(zhuǎn)化成功的植株；利用PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系中AtCAO的轉(zhuǎn)錄情況，并利用western-blotting，特異抗體anti-FLAG檢測(cè)BC-FLAG的蛋白量；明確BC-FLAG在番茄中表達(dá)成功及表達(dá)量；

(3)根據(jù)獲得的轉(zhuǎn)化成功的植株的目標(biāo)基因的表達(dá)情況，篩選出葉綠素含量及葉綠素a/b不盡相同的代表性植株，進(jìn)行后代群體的繁育，并最終篩選出穩(wěn)定遺傳的純合株系。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬南芥葉綠素b合成基因CAO在番茄中的應(yīng)用，其特征是，步驟(1)中：

克隆AtCAO基因的BC區(qū)域的序列；實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱中種植擬南芥，然后剪取擬南芥葉片，使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)提取高質(zhì)量的總mRNA，然后使用Prime ScriptRT Reagent Kit(TAKANA)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；根據(jù)TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)(www.arabidopsis.org)中AtCAO的基因序列設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)AtCAO的BC區(qū)進(jìn)行高保真擴(kuò)增；從載體pEarleyGate302上高保真擴(kuò)增FLAG序列，然后利用重疊PCR將BC與FLAG結(jié)合；

構(gòu)建p35S:BC-FLAG質(zhì)粒并在番茄中過量表達(dá)；利用重疊PCR將35S與BC-FLAG基因片段連接，然后利用In-Fusion將融合序列整合到pENTR載體上，測(cè)序確定序列無誤后，利用GATEWAY方法將目標(biāo)片段整合到二元表達(dá)載體pEarleyGate301；然后利用農(nóng)桿菌GV3101pMP90介導(dǎo)轉(zhuǎn)入番茄中。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的擬南芥葉綠素b合成基因CAO在番茄中的應(yīng)用，其特征是，在實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱中種植擬南芥野生型Columbia(Col-0)；利用農(nóng)桿菌GV3101 pMP90介導(dǎo)轉(zhuǎn)入“浦紅909”番茄中。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的擬南芥葉綠素b合成基因CAO在番茄中的應(yīng)用，其特征是，權(quán)利要求1所述的步驟(2)中，番茄轉(zhuǎn)基因株系中CAO的表達(dá)量的測(cè)定；

篩選BC-FLAG轉(zhuǎn)基因成功的株系并在光照可控的培養(yǎng)箱中種植；采集T1單株的發(fā)育完全的葉片，一方面提取總mRNA，反轉(zhuǎn)錄并利用RT-PCR檢測(cè)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平；另一方面，提取葉片中的總蛋白，利用SDS-PAGE/western blotting分離BC-FLAG蛋白，并用抗FLAG抗體檢測(cè)CAO的積累量，從而確定各株系中BC-FLAG的蛋白量；選取目標(biāo)蛋白的量不同的代表株系，采用快速育種方法繁代，快速獲得穩(wěn)定純合的轉(zhuǎn)基因株系。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬南芥葉綠素b合成基因CAO在番茄中的應(yīng)用，其特征是，BC-FLAG過量表達(dá)株系在弱光條件下的葉綠素含量的檢測(cè)；采集BC-FLAG轉(zhuǎn)基因成功的株系中發(fā)育完全的葉片并稱重，在液氮溫度下，利用提前存儲(chǔ)在零下20攝氏度下的100％的丙酮，通過研磨法提取葉綠素；利用紫外可見分光光度計(jì)法檢測(cè)葉綠素a和葉綠素b的含量；根據(jù)葉綠素a和葉綠素b的量計(jì)算葉綠素a/b比例。