[發明專利]與含酪氨酸磷酸化修飾肽具有親和力的變體SH2結構域

有效

• 申請號: 202011131649.9
• 申請日: 2020-10-21
• 公開（公告）號: CN112250750B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 李磊;黃海明;李樹浩
• 申請（專利權）人: 青島腫瘤研究院;上海納為生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;G01N33/68;C07K1/22;C07K19/00;A61K38/17;A61P35/00;A61P37/02
• 代理公司: 青島發思特專利商標代理有限公司 37212
• 代理人: 趙偉敏

本發明屬于蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的應用技術領域，涉及與含酪氨酸磷酸化修飾肽具有高親和力的變體SH2結構域。本發明提供了一種與含酪氨酸磷酸化修飾肽具有高親和力的變體SH2結構域，包含選自SEQ ID NOs:3、4、5或6的氨基酸序列。本發明將殘基取代已被引入SH2結構域的pTyr?結合區域，闡述了對含pTyr肽的結合親和性增強的有利取代。不同的取代組合表現了對親和性增強的不同程度的影響。這些變體SH2結構域在體外與含pTyr蛋白的結合分析中，表現出其強度遠高于野生型SH2結構域。

技術領域

本發明屬于蛋白酪氨酸激酶（PTKs）的應用技術領域，涉及與含酪氨酸磷酸化修飾肽具有高親和力的變體SH2結構域，具體涉及使用該變體用于治療蛋白酪氨酸激酶相關的失調的方法，例如免疫學的和腫瘤學的失調，涉及使用該變體用于診斷蛋白酪氨酸激酶相關的失調的方法，涉及使用該變體用于檢測、追蹤或監控細胞中的酪氨酸磷酸化事件的方法，涉及使用該變體用于富集或純化含有磷酸酪氨酸的肽或蛋白的方法，以及涉及含有該變體的藥物組合物。

背景技術

蛋白酪氨酸激酶及其底物在多種細胞進程中起重要作用，例如增殖、分化和凋亡。磷酸酪氨酸（還稱為pTyr或pY）信號網中的異常激酶激活和伴隨的改變是多種癌癥的標志。細胞用來翻譯pTyr介導的信號的主要機制依賴于特異性結合酪氨酸磷酸化蛋白的模塊化蛋白結構域。Fyn同源區2（SH2）結構域是這些模塊化結構域中最普遍的，并在PTK信號途徑中起核心作用。不同的pTyr位點使用不同的含SH2結構域的蛋白，后者反過來激活不同的信號途徑。

PTKs包括受體酪氨酸激酶，包括表皮生長因子激酶家族成員。在多種惡性和非惡性增殖性疾病中已經顯示出增強的PTKs活性。此外，PTKs在調節免疫系統細胞中起作用是已知的。

PTKs是用于癌癥治療的重要藥物靶點。目前的抗癌藥主要基于小分子激酶抑制劑或人源化抗體。這些藥物經常表現出對一組相關激酶的廣譜特異性。

抑制PTK信號的替代想法是通過遮蓋PTK底物的磷酸酪氨酸來阻斷下游信號。雖然磷酸酪氨酸特異性抗體對含pTyr多肽具有高親和性，但是它們不能在細胞內使用。

含SH2結構域的蛋白在PTK信號下游起作用，且為信號集合點。SH2結構域含有約100個氨基酸。當分離的SH2結構域在細胞中遞送或表達時，其能夠與結合pTyr位點的內生性信號蛋白競爭。

發明內容

本發明的目的在于增強SH2結構域與含pTyr肽的結合親和性。本發明利用SH2結構域中已引入殘基取代的pTyr-結合區域，闡述了對含pTyr肽的結合親和性增強的有利取代。不同的取代組合表現了對親和性增強的不同程度的影響，并且所產生的變體SH2結構域組（panel）顯示了親和性梯度。這些親和性增強的變體在體外結合分析中和在哺乳動物細胞系中表現出比野生型對照SH2結構域更緊密的與含pTyr的蛋白的結合。因此，變體結構域在生理環境中和在體外條件下都起作用。

本發明是采用以下的技術方案實現的：

在本發明的一個實施方式中，變體SH2結構域包括在親代SH2結構域的8個氨基酸位點的預定義區域中具有至少一個氨基酸取代的親代SH2結構域，該取代增強了變體SH2結構域相對于親代SH2結構域而言對含pTyr肽的親和性。

在本發明的一個實施方式中，當所述親代SH2結構域與SEQ ID NO:1對齊時，親代SH2結構域的8個氨基酸的預定義的區域對應于SEQ ID NO:1的Lys19(位點1)、Glu41(位點2)、Thr42(位點3)、Thr43(位點4)、Ala46(位點5)、Ser48(位點6)、Lys63(位點7)和Lys66(位點8)。

本發明提供了一種與含酪氨酸磷酸化修飾肽具有高親和力的變體SH2結構域，包含選自SEQ ID NOs: 3、4、5或6的氨基酸序列。

在本發明的變體SH2結構域的另一個實施方式中，親代SH2結構域是真核的(eukaryotic)。