[發(fā)明專利]基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011123536.4
• 申請(qǐng)日: 2020-10-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112342211B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-08-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 易犁;汪聲晨;張發(fā)英;云月利;張桂敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12N15/70;C12Q1/37;G01N15/14
• 代理公司: 武漢泰山北斗專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42250
• 代理人: 程千慧

1.基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、將超折疊綠色熒光蛋白sfGFP融合在HRV 3C蛋白酶底物序列LEVLFQ↓GP的N端,將SsrA降解標(biāo)簽融合在HRV 3C蛋白酶底物序列的C端，得到HRV 3C蛋白酶底物多肽sfGFP-LEVLFQGP-SsrA ；

步驟2、將sfGFP-LEVLFQGP-SsrA整合到大腸桿菌的染色體上，得到大腸桿菌重組菌株，HRV 3C 蛋白酶的切割位點(diǎn)為K82、L94或N107；

步驟3、將HRV 3C 蛋白酶拆分為N端HRV 3C蛋白酶結(jié)構(gòu)域和C端HRV 3C蛋白酶結(jié)構(gòu)域，將捕獲蛋白融合到N端HRV 3C蛋白酶結(jié)構(gòu)域，得到第一重組蛋白；將誘餌蛋白融合到C端HRV3C蛋白酶結(jié)構(gòu)域，得到第二重組蛋白；

步驟4、將第一重組蛋白和第二重組蛋白轉(zhuǎn)入大腸桿菌重組菌株中共表達(dá)，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)重組大腸桿菌細(xì)胞的綠色熒光信號(hào)，若檢測(cè)到有綠色熒光信號(hào)，則說(shuō)明捕獲蛋白和誘餌蛋白之間存在相互作用，若檢測(cè)到?jīng)]有綠色熒光信號(hào)，則說(shuō)明捕獲蛋白和誘餌蛋白之間不存在相互作用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟2中HRV 3C 蛋白酶的切割位點(diǎn)為K82位點(diǎn)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用檢測(cè)方法，其特征在于，所述SsrA降解標(biāo)簽可被大腸桿菌內(nèi)源性ClpXP降解復(fù)合物所識(shí)別，從而導(dǎo)致SsrA的N端融合的蛋白降解。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用檢測(cè)方法，其特征在于，所述HRV 3C蛋白酶底物N端融合有sfGFP, C端融合有SsrA降解標(biāo)簽；所述HRV 3C蛋白酶底物多肽為sfGFP-LEVLFQGP-SsrA。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用檢測(cè)方法，其特征在于，所述捕獲蛋白和誘餌蛋白為待研究相互作用的目的蛋白對(duì)；所述捕獲蛋白融合在N端HRV 3C蛋白酶結(jié)構(gòu)域，誘餌蛋白融合在C端HRV 3C蛋白酶結(jié)構(gòu)域。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用檢測(cè)方法，其特征在于，所述捕獲蛋白和誘餌蛋白發(fā)生相互作用時(shí)，N端和C端HRV 3C 蛋白酶融合形成具有完整功能的HRV 3C蛋白酶，對(duì)相應(yīng)底物多肽切割識(shí)別，導(dǎo)致sfGFP信號(hào)的積累和細(xì)胞熒光強(qiáng)度的提升。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于split-HRV 3C蛋白酶的蛋白相互作用檢測(cè)方法，其特征在于，所述sfGFP信號(hào)可以通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。