[發明專利]基于均相化學發光法檢測豬瘟病毒抗體的試劑盒及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202011122129.1
• 申請日: 2020-10-20
• 公開（公告）號: CN112255400A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發明（設計）人: 查銀河;童夏霞;舒建洪;黃磊;楊芳;陳聰;周泉麗;林渝鈞;趙海波
• 申請（專利權）人: 浙江洪晟生物科技股份有限公司;浙江理工大學;浙江理工大學紹興生物醫藥研究院有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/532;G01N21/76
• 代理公司: 浙江納祺律師事務所 33257
• 代理人: 王士祥;鄭滿玉

本發明公開了一種基于均相化學發光法檢測豬瘟病毒抗體的試劑盒，所述試劑盒包括試劑R1、試劑R2和陽性對照、陰性對照，本發明還公開了一種該試劑盒的制備方法和應用，本發明所述供體微球能夠在激發狀態產生活性氧，所述受體微球能夠與活性氧反應生成可檢測的化學發光信號，因此在檢測時不需要清洗和分離，可以直接檢測化學發光信號，從而實現豬瘟病毒抗體的檢測，另外，本發明的試劑盒10min內即可完成抗體檢測，且本發明的試劑盒的特異性、敏感性、重復性都很好。

技術領域

本發明屬于生物診斷試劑技術領域，尤其涉及基于均相化學發光法檢測豬瘟病毒抗體的試劑盒及其制備方法和應用。

背景技術

豬瘟(Classical swine fever,CSF或Hog cholera,HC)，又稱經典豬瘟或古典豬瘟，是豬的一種高傳染性疾病。豬瘟會導致患病豬發燒、厭食、腹瀉、死亡等，并可能伴有神經癥狀，母豬可能會流產或產下死豬崽，豬瘟為世界動物衛生組織所列的A類中16種法定傳染病之一。古典豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)為黃病毒科瘟疫病毒屬，同屬的病毒還有感染反芻動物的牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhoea virus,BVDV)及羊的邊界病病毒(Border Disease virus,BDV)。豬是古典豬瘟病毒的唯一宿主和傳播源。受到感染的豬在發病前和發病期間都會排毒。

CSFV為有囊膜病毒，40-60nm，單股正鏈RNA。CSFV基因組長約123kb，僅含有一個大的開放性閱讀框架(ORF)，此ORF翻譯成含3898個氨基酸殘基，分子量約438kDa的多聚蛋白，并進一步在病毒和宿主細胞蛋白酶的作用下加工為成熟蛋白。CSFV的所有結構蛋白和非結構蛋白均由該ORF所編碼，ORF兩側是5’-端非翻譯區(5’-UTR)和3’-端非翻譯區(3’-UTR)，且5’-端無帽子結構，3’-端無poly(A)尾巴。這一大前體蛋白以共翻譯和后翻譯的形式在細胞蛋白酶和病毒特異蛋白酶作用下，加工成結構蛋白和非結構蛋白，其結構蛋白和非結構蛋白在病毒RNA上的編碼順序為Npro、c、Erns(E0)、E1、E2、 P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80)，除c、E0、E1和E2為結構蛋白外.其余均為非結構蛋白。

E2為CSFV的囊膜糖蛋白，是病毒主要的抗原蛋白，也是三個病毒糖蛋白中保守性最低.最易變異的分子。E2常以100kDa的同源二聚體及與E1形成 75kDa的異源二聚體形式存在于病毒粒子及CSFV感染的細胞表面。在體外E2 可誘導產生病毒的中和抗體，體內可誘導產生抗CSFV的攻擊的抗體。E2的蛋白骨架由370個氨基酸(ORF編碼的690-1060氨基酸殘基)組成.并以其c端的40個疏水氨基酸錨定在膜上。由于糖基化程度不同。E2的分子量可為51-58kDa。E2分子內的15個Cys殘基在屬內均保守，其中N端6個Cys殘基參與抗原結構域的形成，c端9個Cys殘基則參與同源、異源二聚體的形成。因此，選擇豬瘟E2蛋白作為抗體檢測的靶標最為合適。

國內外許多實驗室已經研發出許多豬瘟病毒抗體的檢測方法，例如酶聯免疫吸附實驗法，膠體金免疫層析法，熒光免疫層析法等等。ELISA檢測方法耗時耗力；膠體金和熒光免疫層析法屬于定性和半定量檢測，結果準確度不高。迫切需要精準、快速的檢測產品，化學發光法是最好的選擇，但磁微粒化學發光成本較高，且對儀器設備的要求就高，因此均相化學發光技術是一個合適的選擇。該技術與ELISA檢測方法相比，操作簡單，反應時間短，該方法敏感性與精確度好，檢測范圍很廣。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有豬瘟病毒抗體檢測方法存在費時費力等問題，從而提出的一種基于均相化學發光法檢測豬瘟病毒抗體的試劑盒及其制備方法和應用。