[發(fā)明專(zhuān)利]比格犬血漿中達(dá)拉他韋的定量檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011121404.8
• 申請(qǐng)日: 2020-10-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112285229A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭恒;丁玉峰;劉義偉;馮湘玲;曹艷;石友泉
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/02
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/24;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/72;G01N30/86;G01N30/88
• 代理公司: 武漢開(kāi)元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 胡鎮(zhèn)西;程杰

本發(fā)明公開(kāi)了一種比格犬血漿中達(dá)拉他韋的定量檢測(cè)方法，屬于藥物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。它包括如下步驟：1)配制達(dá)拉他韋系列工作溶液和達(dá)拉他韋?d6內(nèi)標(biāo)工作溶液；2)待測(cè)比格犬血漿的預(yù)處理；3)配制系列校正標(biāo)樣及隨行質(zhì)控樣品；4)測(cè)定待測(cè)比格犬血漿中達(dá)拉他韋濃度；其中，以達(dá)拉他韋和內(nèi)標(biāo)達(dá)拉他韋?d6的色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，以比格犬空白血漿中達(dá)拉他韋的濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出待測(cè)比格犬血漿中達(dá)拉他韋濃度。本發(fā)明還選擇采用蛋白沉淀法對(duì)比格犬血漿樣品進(jìn)行處理，以電噴霧離子源作為電離技術(shù)，檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好、選擇性高、檢測(cè)限低、分析時(shí)間短且適合比格犬血漿樣本的高通量定量測(cè)定和臨床前比格犬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種藥物濃度的檢測(cè)，屬于藥物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種比格犬血漿中達(dá)拉他韋的定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

丙型肝炎是臨床常見(jiàn)的傳染性疾病之一，丙肝已被公認(rèn)為是造成全球慢性肝臟疾病的主要原因，約有27％肝硬化、25％肝細(xì)胞癌是由丙肝引起的。丙肝已成為一種不容忽視的公共衛(wèi)生問(wèn)題，引起了全社會(huì)的廣泛關(guān)注。

達(dá)拉他韋是一種選擇性HCV非結(jié)構(gòu)蛋白5a復(fù)制體抑制劑，對(duì)多個(gè)慢性丙型肝炎(HCV)基因型/亞型具有高度特異性，對(duì)宿主細(xì)胞的毒性較低。其由百時(shí)美施貴寶公司研發(fā)，2014年底獲歐盟批準(zhǔn)上市，聯(lián)合其他藥物，用于1、2、3、4基因型慢性丙型肝炎(HCV)成人感染者的治療。并于2017年4月，中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)鹽酸達(dá)拉他韋片和阿舒瑞韋膠囊進(jìn)口上市，用于成人慢性丙型肝炎的聯(lián)合治療，這是國(guó)內(nèi)首次獲批全口服抗丙型肝炎病毒的藥物(DAA)。直接抗病毒藥物(DAAs)的問(wèn)世開(kāi)創(chuàng)了丙型肝炎治療新時(shí)代，使丙型肝炎的臨床治愈成為可能。

鹽酸達(dá)拉他韋(Daclatasvir Dihydrochloride)，化學(xué)名為((1S)-1-(((2S)-2-(5-(4’-(2-((2S)-1-((2S)-2-((甲氧羰基)氨基)-3-甲基丁酰基)-2-吡咯烷基)-1H-咪唑-5-基)-4-聯(lián)苯基)-1H-咪唑-2-基)-1-吡咯烷基)羰基)-2-甲基丙基)氨基甲酸甲酯二鹽酸鹽，其結(jié)構(gòu)如下所示：

百時(shí)美施貴寶公司在專(zhuān)利CN101778841A中公開(kāi)了一種鹽酸達(dá)拉他韋的合成方法，并提到了其精制方法，中國(guó)專(zhuān)利CN109305962A公開(kāi)了一種鹽酸達(dá)拉他韋的精制方法。然而現(xiàn)有技術(shù)并未公開(kāi)關(guān)于其在動(dòng)物體內(nèi)的藥物檢測(cè)方法，因此需要開(kāi)發(fā)一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的分析方法來(lái)定量血漿中達(dá)拉他韋的濃度。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種比格犬血漿中達(dá)拉他韋的定量檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法不僅具備操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性好、選擇性高、檢測(cè)限低、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還適合對(duì)比格犬血漿樣本的高通量定量測(cè)定。

為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明公開(kāi)了一種比格犬血漿中達(dá)拉他韋的定量檢測(cè)方法，它包括如下步驟：

1)配制達(dá)拉他韋系列工作溶液和達(dá)拉他韋-d6內(nèi)標(biāo)工作溶液；

2)待測(cè)比格犬血漿的預(yù)處理：向待測(cè)比格犬血漿中加入步驟1)所述達(dá)拉他韋-d6內(nèi)標(biāo)工作溶液及乙腈沉淀劑后，經(jīng)過(guò)首次渦旋混合、離心分離、上清液加純化水和二次渦旋混合后得處理后待測(cè)比格犬血漿；

3)配制系列校正標(biāo)樣及隨行質(zhì)控樣品：將步驟1)所述達(dá)拉他韋系列工作溶液分為兩份，分別加入比格犬空白血漿后，制備得到系列校正標(biāo)樣及隨行質(zhì)控樣品；

4)測(cè)定待測(cè)比格犬血漿中達(dá)拉他韋濃度：取待測(cè)比格犬血漿、步驟3)的系列校正標(biāo)樣、隨行質(zhì)控樣品按步驟2)的方式預(yù)處理后分別送入LC-MS/MS中進(jìn)行測(cè)定，以達(dá)拉他韋和內(nèi)標(biāo)達(dá)拉他韋-d6的色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，以比格犬空白血漿中達(dá)拉他韋的濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出待測(cè)比格犬血漿中達(dá)拉他韋濃度。