[發(fā)明專利]一種同時(shí)檢測(cè)BK病毒和人巨細(xì)胞病毒的試劑盒及其檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011120074.0
• 申請(qǐng)日: 2020-10-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112226537A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 古柏燕;彭忠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 珞可為科技（武漢）有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 北京知元同創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11535
• 代理人: 彭勁松

1.一種針對(duì)BK病毒和人巨細(xì)胞病毒的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)用引物及探針，其特征在于，探針序列的5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)，具體序列如下：

BK病毒：

BK上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，

BK下游引物:核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，

BK特異性熒光探針:核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，

人巨細(xì)胞病毒：

CMV上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，

CMV下游引物:核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，

CMV特異性熒光探針:核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)BK病毒和人巨細(xì)胞病毒的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)用引物及探針，其特征在于，所述BK病毒探針和人巨細(xì)胞病毒探針上帶有的熒光報(bào)告基團(tuán)選自6-羧基熒光素、六氯-6-甲基熒光素、VIC熒光染料、四氯-6-羧基熒光素、羧基-X-羅丹明、6-羧基四甲基羅丹明、磺酰羅丹明、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基熒光素琥珀酰亞胺酯、花菁3、花菁3.5、花菁5和花菁5.5中的至少一種；所述BK病毒特異性探針和人巨細(xì)胞病毒特異性探針上帶有的熒光淬滅基團(tuán)選自6-羧基四甲基羅丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬滅劑1、黑洞淬滅劑2或黑洞淬滅劑3中的至少一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的針對(duì)BK病毒和人巨細(xì)胞病毒的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)用引物及探針，其特征在于，所述BK病毒探針和人巨細(xì)胞病毒探針上帶有的熒光報(bào)告基團(tuán)，所述熒光報(bào)告基團(tuán)選自6-羧基熒光素或六氯-6-甲基熒光素；所述熒光淬滅基團(tuán)選自黑洞淬滅劑1；作為優(yōu)選，BK病毒探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為六氯-6-甲基熒光素，熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1；人巨細(xì)胞病毒探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為6-羧基熒光素，熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1。

4.一種BK病毒和人巨細(xì)胞病毒聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1-3任一所述的兩種病毒的檢測(cè)用引物及探針，所述BK病毒探針、人巨細(xì)胞病毒探針上分別帶有不同的熒光報(bào)告基團(tuán)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的BK病毒和人巨細(xì)胞病毒聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒在使用時(shí)按以下比例配制引物、探針混合液：BK病毒擴(kuò)增引物對(duì)與BK病毒探針的摩爾比為3:1，人巨細(xì)胞病毒擴(kuò)增引物對(duì)與人巨細(xì)胞病毒探針的摩爾比為2:1，BK病毒探針、人巨細(xì)胞病毒探針的摩爾比為2:1。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的BK病毒和人巨細(xì)胞病毒聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，其中陰性對(duì)照品為生理鹽水溶液；陽(yáng)性對(duì)照品包括含有BK病毒靶序列的質(zhì)粒、含有人巨細(xì)胞病毒靶序列的質(zhì)粒；作為優(yōu)選，陽(yáng)性對(duì)照品包括含有由如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示序列擴(kuò)增獲得的BK病毒靶序列的質(zhì)粒、含有由如SEQ ID No.4及SEQ ID No.5所示序列擴(kuò)增獲得的人巨細(xì)胞病毒靶序列的質(zhì)粒。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的BK病毒和人巨細(xì)胞病毒聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括DNA提取試劑、dNTPs、PCR反應(yīng)液、酶中的至少一種，所述PCR反應(yīng)液包括220mM～280mM的Tris-base、質(zhì)量百分含量為0.2％～0.3％的TritonX-100和20mmol/L～30mmol/L的MgCl₂；所述酶為Taq酶。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的BK病毒和人巨細(xì)胞病毒聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的PCR反應(yīng)液包括250mM的Tris-base、質(zhì)量百分含量為0.25％的TritonX-100和25mmol/L的MgCl₂。

9.權(quán)利要求4-8任一項(xiàng)所述的BK病毒和人巨細(xì)胞病毒聯(lián)合檢測(cè)試劑盒在制備檢測(cè)BK病毒和人巨細(xì)胞病毒的試劑中的應(yīng)用。

10.一種BK病毒和人巨細(xì)胞病毒的聯(lián)合檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法是非診斷非治療目的，包括以下步驟：

(1)提取待檢樣品的DNA；

(2)以待測(cè)樣品DNA為模板，加入權(quán)利要求4-8任一在同一反應(yīng)中檢測(cè)BK病毒和人巨細(xì)胞病毒的試劑盒中的各組分進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)分析，如果各檢測(cè)通道都沒(méi)有出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，判為兩種病毒均為陰性；如果檢測(cè)通道出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，Ct值≤38，則對(duì)應(yīng)的病毒判定為陽(yáng)性；

上述在同一反應(yīng)中檢測(cè)BK病毒和人巨細(xì)胞病毒的檢測(cè)方法中多重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件為：93℃～95℃預(yù)變性2min～10min；93℃～95℃變性10s～30s，55℃～60℃退火、延伸、信號(hào)采集30s～60s，循環(huán)40次～45次。