[發(fā)明專利]一種非石蠟切片法熒光標記細胞團細胞的方法

在審

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• 申請日: 2020-10-19
• 公開（公告）號: CN112255398A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發(fā)明（設計）人: 楊信志
• 申請（專利權）人: 福建醫(yī)科大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/58;G01N21/64
• 代理公司: 重慶市嘉允啟行專利代理事務所(普通合伙) 50243
• 代理人: 胡柯

本發(fā)明提供一種非石蠟切片法熒光標記細胞團細胞的方法，采用免疫熒光染色和非免疫熒光標記兩種染色方法分別對細胞團的細胞膜和細胞核進行熒光染色，來觀察非石蠟切片法在熒光標記細胞團的細胞中的適用情況，具體步驟如下：1)全細胞準備；2)將步驟1)中的全細胞進行細胞團培養(yǎng)；3)對步驟2)中的細胞團進行非免疫熒光標記；4)對步驟2)中的細胞團進行免疫熒光標記；5)對步驟3)和步驟4)中的熒光標記后的細胞團進行激光共聚焦顯微觀察，實驗步驟簡單、結果快速、用時短、使用樣本量少、實驗過程避免用到有害的揮發(fā)性試劑等，且真實反映了膜蛋白的原始性質，得到的結果更加真實、清楚。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種非石蠟切片法熒光標記細胞團細胞的方法。

背景技術

細胞的聚團培養(yǎng)首先被Reynold和Weiss用于分離干細胞。之后，細胞聚團培養(yǎng)方法被應用于許多細胞的研究，比如神經干細胞、角膜干細胞、腫瘤干細胞等等。我們經常會對培養(yǎng)的細胞進行熒光染色分析。對貼壁培養(yǎng)的細胞進行定性熒光分析時，由于細胞單層貼壁，我們則可以不經過石蠟包埋而直接對細胞固定染色。但對細胞團進行熒光染色來做定性的分析時，我們通常會對細胞團進行石蠟包埋切片。這種石蠟切片技術要經過固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、脫蠟等一系列復雜而耗時的程序，并且這種劇烈的處理方法還會對細胞中的抗原有著一定程度的損害。

人輸卵管內膜干細胞可以在三維凝膠培養(yǎng)系統(tǒng)中形成細胞團塊，并且輸卵管內膜干細胞都是呈上皮特異性黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)陽性。EpCAM是一種跨膜蛋白，廣泛分布于上皮細胞及快速增殖的腫瘤細胞上，我們利用小鼠抗EpCAM的一抗對輸卵管內膜干細胞團細胞進行標記，然后用Dylight-488的偶聯(lián)山羊抗小鼠的IgG來結合一抗，來探討細胞團的EpCAM的檢出情況。

EdU是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)摻入正在復制的DNA分子中，通過基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應快速檢測細胞DNA復制活性，可快速準確的檢測細胞的增殖能力。與BrdU檢測方法相比，EdU檢測方法更快速、更靈敏、更準確。EdU與T非常相似，而且EdU染料只有BrdU抗體的1/500，在細胞內很容易擴散，無需DNA變性(酸解、熱解、酶解等)，可有效避免樣品損傷，而且無需抗原抗體反應，能在細胞和組織水平更快速便捷地反映DNA復制活性。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種非石蠟切片法熒光標記細胞團細胞的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種非石蠟切片法熒光標記細胞團細胞的方法，采用免疫熒光染色和非免疫熒光標記兩種染色方法分別對細胞團的細胞膜和細胞核進行熒光染色，來觀察非石蠟切片法在熒光標記細胞團的細胞中的適用情況，具體步驟如下：

1)全細胞準備；

2)將步驟1)中的全細胞進行細胞團培養(yǎng)；

3)對步驟2)中的細胞團進行非免疫熒光標記；

4)對步驟2)中的細胞團進行免疫熒光標記；

5)對步驟3)和步驟4)中的熒光標記后的細胞團進行激光共聚焦顯微觀察。

進一步，步驟1)中所述全細胞準備的具體步驟為：取6-8周齡ICR雌鼠，斷頸處死后取輸卵管，去掉周圍的脂肪組織及系膜，用眼科鑷子撕碎，放入含有0.25mg/ml的膠原蛋白酶I和II的PBST中，37℃消化20分鐘，然后輕輕吹打使細胞分散，300g離心5min后加入5ml含10％FBS的PrEGM培養(yǎng)基懸浮細胞，然后通過直徑為40μm的細胞過濾器過濾掉沒有消化的組織團塊，得到細胞懸浮液，300g離心5min，再用含10％FBS的PrEGM培養(yǎng)液稀釋至細胞濃度為1×10⁷/ml，得到細胞溶液備用。