[發明專利]Hspg2基因敲入小鼠動物模型的構建方法和應用

有效

• 申請號: 202011117319.4
• 申請日: 2020-10-19
• 公開（公告）號: CN112458086B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 李清剛;陳香美;尚順來
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院第一醫學中心
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 北京三友知識產權代理有限公司 11127
• 代理人: 劉鑫;李輝

1.一種特異性靶位點導向RNA在用于構建作為篩查防治狼瘡性腎炎藥物和/或研究臨床狼瘡性腎炎發生發展病程的Hspg2基因敲入小鼠動物模型中的應用，其中，所述特異性靶位點導向RNA包括sgRNA6和sgRNA12，所述sgRNA6和所述sgRNA12的核苷酸序列如下：

sgRNA6：AGAATGACGGCACTGCCCCAGGG(SEQ ID NO:6)；

sgRNA12：TGGACTGTAACTCCCAAGCTGGG(SEQ ID NO:12)。

2.一種Hspg2基因敲入小鼠動物模型在作為篩查防治狼瘡性腎炎藥物和/或研究臨床狼瘡性腎炎發生發展病程的動物模型中的應用，其中，所述的Hspg2基因敲入小鼠動物模型的構建方法包括以下步驟：

將sgRNA6、sgRNA12與Cas9質粒體外轉錄成mRNA，獲得有活性的sgRNA6、sgRNA12和Cas9mRNA；所述sgRNA6和所述sgRNA12的核苷酸序列如下：sgRNA6：AGAATGACGGCACTGCCCCAGGG(SEQ ID NO:6)；sgRNA12：TGGACTGTAACTCCCAAGCTGGG(SEQ ID NO:12)；

構建Hspg2基因敲入的打靶載體；

將有活性的sgRNA6、sgRNA12、Cas9 mRNA和打靶載體注射入小鼠受精卵中，培育受精卵并進行傳代，構建獲得Hspg2基因敲入的小鼠動物模型。

3.根據權利要求2所述的應用，其中，構建Hspg2基因敲入的打靶載體的步驟包括：

根據打靶策略設計引物，構建同源臂片段LR、同源臂片段RR以及引入點突變的序列片段A；

將同源臂片段LR、同源臂片段RR和序列片段A通過克隆組裝到TV-4G載體上，構建獲得打靶載體；

通過酶切鑒定和測序，確認打靶載體構建成功。

4.根據權利要求3所述的應用，其中，所述打靶策略為：根據人Hspg2基因上的點突變對應找到小鼠的同源點突變，將小鼠Hspg2基因的第2936位氨基酸Gly突變為Glu，即：G2936E，相對應的堿基由GGG變為GAG，即G8807A。

5.根據權利要求3所述的應用，其中，根據打靶策略設計引物，包括：

構建同源臂LR片段的引物序列如下：

EGE-DJH-027-LR-F：

TTTAAGAAGGAGATATACATGCTCGAGATGAATTGGTCAAGGATGTGGGACC(SEQ ID NO:17)；

EGE-DJH-027-LR-R：

TGACGGCACTGCCGATATCCCTCTAGCAGGCCAGGGCTAACAGGATGAAATGTAC(SEQ ID NO:18)；

構建點突變的序列片段A的引物序列如下：

EGE-DJH-027-A-F：

CTGTTAGCCCTGGCCTGCTAGAGGGATATCGGCAGTGCCGTCATTCTGCGTTTTA(SEQ ID NO:19)；

EGE-DJH-027-A-R(in)：

CACTTCAGATCTACAGTCTGCTCTTCAGTCAAATGGGAGGAGGAG(SEQ IDNO:20)；

EGE-DJH-027-A-F(in)：

CCTCCCATTTGACTGAAGAGCAGACTGTAGATCTGAAGTGCGTGG(SEQ IDNO:21)；

EGE-DJH-027-A-R：

TGTAACTCCCAAAGATCTGGATCCGTCGACGCTGGGACCTGAAATAAGTCCTCCC(SEQ ID NO:22)；

構建同源臂RR片段的引物序列如下：

EGE-DJH-027-RR-F：

TCAGGTCCCAGCGTCGACGGATCCAGATCTTTGGGAGTTACAGTCCATCAAAGCA(SEQ ID NO:23)；

EGE-DJH-027-RR-R：

TTGTTAGCAGCCGGATCTCAGGCGGCCGCCAGCCTCCAAGGTCAGCTCAGATTC(SEQ ID NO:24)。