[發明專利]一種脂肪干細胞的分離方法

在審

• 申請號: 202011115044.0
• 申請日: 2020-10-19
• 公開（公告）號: CN112175902A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 李青峰;周雙白;張曉杰
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N13/00;A61K35/28;A61P17/02;A61P17/18;A61P19/02;A61P29/00;A61P9/00
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

本發明涉及生物醫學領域，特別是涉及一種脂肪干細胞的分離方法，所述分離方法包括將脂肪組織與濃度為0.05～0.3％(m/v)的膠原酶混合后，再進行超聲處理。本發明的分離方法減少酶對細胞的損傷，有效提高獲得的脂肪干細胞的活性；每單位體積分離獲得的有活性的脂肪干細胞數量較現有方法提高30％；較現有方法減少50％的酶用量，使發生超敏反應的可能性降低，有效降低了分離細胞所需成本；較現有方法減少酶與細胞作用時間的2/3，對細胞活性影響小，有效的減少膠原酶可能造成的細胞損傷和對人體的潛在風險。

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，特別是涉及一種脂肪干細胞的分離方法。

背景技術

目前，隨著干細胞應用技術的不斷發展，臨床對干細胞治療的需求也是日益增長。脂肪干細胞是從脂肪組織中提取的一種間充質干細胞，具有多向分化能力，合成多種生長因子的能力，促進組織再生與修復的能力，已被證實在多種疾病的治療上有良好的臨床效果。脂肪干細胞的巨大應用前景，要求其能達到快速分離、保持高細胞活性，對脂肪干細胞的分離方法提出了新的要求，需要開發一種更快速高效的分離方法。

現有的分離技術主要為酶消化法，通過膠原酶消化處理抽取的脂肪組織，使細胞間連結解離，細胞可以脫落下來，通過離心方式使密度較大的脂肪干細胞和密度較小的脂肪細胞分層，收集下層的脂肪干細胞。此方法雖然產量較高，但存在的主要問題有：耗時長，即便是技術熟悉的人員操作，也需要1.5小時才能完成分離；為提高效率需要較高濃度的膠原酶，而高濃度膠原酶會增加其殘留的比率，增加發生過敏等不良反應的概率，從而增加了異種蛋白對人體產生危害的風險，且膠原酶濃度較高增加了分離成本；效率不穩定：該方法對細胞分離效率和獲得細胞質量的一個重要影響步驟為膠原酶消化的是否適度，消化時間過短，消化不充分，則細胞獲得率低；消化時間過長，消化過度，則細胞活性低。是否達到適度消化，仍是依賴于操作人員經驗，需要較長的學習曲線才能達到較好的操作效果。其他分離方法還包括通過機械力(直接離心法、震蕩離心法、旋渦離心法、吸附柱法等)方式使脂肪干細胞從細胞外基質上脫落后收集細胞，這些方法雖然耗時較短，但產量低，效率低，無法推廣應用。因此，目前仍缺乏安全、高效的干細胞分離方法。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種脂肪干細胞的分離方法，用于解決現有技術中的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種脂肪干細胞的分離方法，所述分離方法包括將脂肪組織與濃度為0.05～0.3％(m/v)的膠原酶混合后，再進行超聲處理。

優選地，所述脂肪組織選自動物脂肪組織或人脂肪組織。

優選地，所述膠原酶選自單一類型的膠原酶或混合型的膠原酶。

優選地，所述單一類型的膠原酶為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型中的任一種；所述混合型的膠原酶為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型中的幾種類型的組合。

優選地，所述脂肪組織與膠原酶的體積比為1:1～1:1.5。

優選地，所述超聲處理的功率選自50～200W。

優選地，所述超聲處理的時間為30～150秒。

優選地，所述分離方法還包括以下步驟：

1)將超聲處理后的混合液置于搖床中繼續消化，直至消化成均勻混懸液；

2)將消化后獲得的混懸液離心，棄上層脂肪細胞和中間的液體，保留底層的脂肪干細胞團；

3)用磷酸緩沖鹽溶液或生理鹽水洗滌脂肪干細胞團，洗滌后重懸即獲得脂肪干細胞單細胞懸液。

優選地，步驟1)中，所述搖床的溫度為35～37℃，繼續消化時間為20～30分鐘。