[發明專利]阿爾茨海默病標志物p-Tau217檢測試劑盒及其制造方法

在審

• 申請號: 202011109866.8
• 申請日: 2020-10-16
• 公開（公告）號: CN112505322A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 李紅江;辛曉文;孫榮同;王有志;王鵬浩
• 申請（專利權）人: 威海紐普生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/543;G01N33/577;G01N21/64
• 代理公司: 威海科星專利事務所 37202
• 代理人: 初姣姣

1.一種阿爾茨海默病標志物p-Tau217檢測試劑盒，設有試紙卡，所述試紙卡設有PVC板，PVC板上依次設有相搭接的樣品墊、結合墊、反應墊、包被膜、吸水墊，其特征在于，其中結合墊上分別吸附有稀土熒光羧基微球標記的親和素-生物素化的p-Tau217檢測抗體復合物及熒光羧基微球-雞IgY復合物；包被膜上T線包被p-Tau217捕獲抗體、C線包被羊抗雞IgY抗體；所述稀土熒光羧基微球的直徑為200nm-350nm，稀土熒光羧基微球摻雜稀土鑭系元素，在基態下穩定，在340-380nm的激發光源作用下發射出波長范圍在600-630nm的熒光；所述抗體為純化后的單克隆抗體，來源于針對2-6個不同的p-Tau217抗原表位的單克隆抗體細胞株。

2.一種阿爾茨海默病標志物p-Tau217檢測試劑盒，其特征在于，所述結合墊的稀土熒光羧基微球的直徑范圍是200-250nm；所述稀土熒光羧基微球摻雜有稀土鑭系元素，為銪(Eu)、釤(Sm)、鉺(Er)、釹(Nd)等鑭系元素的任意一種或幾種的混合物；所述稀土熒光羧基微球摻雜稀土絡合物；結合墊上稀土熒光羧基微球標記的抗體來源于針對3個不同抗原表位的單克隆細胞細胞株。

3.一種如權利要求1或2所述阿爾茨海默病標志物p-Tau217檢測試劑盒的制造方法，其特征在于，所述結合墊采用如下步驟制得：將玻璃纖維膜浸泡于0.1M硼砂-硼酸pH8.8、0.1％Tween80及0.1％酪蛋白、0.05％P300處理液中，4℃浸泡2小時，然后取出37℃烘箱烘干24小時，備用，將玻璃纖維膜在Bio-DotXYZ3050三維噴點平臺上，用Bio-Jet Quanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光羧基微球標記的親和素-生物素化的p-Tau217檢測抗體復合物及熒光羧基微球-雞IgY復合物噴到玻璃纖維膜，37℃烘干2小時后制得；

其中結合墊上的稀土熒光羧基微球標記親和素-生物素-p-Tau217單克隆抗體及熒光羧基微球-雞IgY采用如下步驟制得：

步驟1：單克隆抗體細胞株的獲得：參照p-Tau217氨基酸序列，選擇抗原性強的位點人工合成20個氨基酸左右的多肽序列，交聯到KLH上，采用標準的單克隆抗體制備方法制備特異性高親和力的單克隆抗體細胞株，將所獲得的細胞株對應的單克隆抗體進行配對實驗和親和力測定實驗，根據實驗結果確定捕獲抗體和檢測抗體；

步驟2：單克隆抗體的制備：采用標準的腹水生產工藝制備并純化用于檢測的p-Tau217單克隆抗體，分裝后保存于-20℃備用；

步驟3：稀土熒光羧基微球標記的生物素話的p-Tau217單克隆抗體的制備：將1mg用于鏈霉親和素和與稀土熒光羧基微球混合，通過EDC/NHS的作用，4℃反應過夜，將親和素和羧基微球偶聯；然后，加入終濃度為2％Gly，4℃反應4小時封閉；然后用100mM Tris-HCL，pH8.5的緩沖液采用離心法洗滌3遍，重懸于1mL的100mM pB7.2緩沖液中，然后加入0.5mg生物素化的p-Tau217抗體，37℃孵育20分鐘，然后離心10分鐘，棄上清，沉降的微球-親和素-生物素化的p-Tau217抗體復合物用0.1M Tris-HCL 8.0、4％海藻糖、0.1％Tween20重懸；

步驟4：稀土熒光羧基微球標記的雞IgY的制備：將1mg雞IgY和與稀土熒光羧基微球混合，通過EDC/NHS的作用，4℃反應過夜，將雞IgY和羧基微球偶聯；然后，加入終濃度為2％Gly，4℃反應4小時封閉；然后用100mM Tris-HCL，pH8.5的緩沖液采用離心法洗滌3遍，然后離心10分鐘，棄上清，沉降的微球-IgY復合物用0.1M Tris-HCL 8.0、4％海藻糖、0.1％Tween20重懸，4℃儲存備用。

4.一種如權利要求3所述阿爾茨海默病標志物p-Tau217檢測試劑盒的制造方法，其特征在于，所述包被有檢測線和質控線的硝酸纖維素膜通過以下步驟制得：

根據配對實驗和親和力測定實驗，選擇用于捕獲的抗體對應的單克隆抗體細胞株，按照標準的腹水生產工藝制備并純化用于捕獲的p-Tau217單克隆抗體，保存于-20℃備用；

分別用包被稀釋液將p-Tau217單克隆抗體和羊抗雞IgY抗體調整濃度到1-5mg/ml，膜液量為1-2μl/cm，將它們分別作為檢測線和質控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進行包被，檢測線和質控線間隔為3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干96小時。