[發明專利]酵母定點雙DSB同步誘導模型的構建方法

在審

• 申請號: 202011103304.2
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN112239765A
• 公開（公告）日: 2021-01-19
• 發明（設計）人: 馬文建;周颯;李心雨;陳特長;張宇潔;謝詩懿;李瑞清
• 申請（專利權）人: 天津科技大學;齊魯理工學院
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/81;C12N15/65;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.一種酵母定點雙DSB同步誘導模型的構建方法，其特征在于：步驟如下：

⑴設計上、下游引物，引物兩端加上I-SceI識別位點，用上、下游引物將釀酒酵母誘導型啟動子控制的I-SceI基因的表達盒及KanMX篩選基因GAL-I-SceI-KanMX從質粒pGSKU擴增下來；

⑵設計第二段引物進行第二次PCR擴增，使上、下游引物的同源臂為70-80bp；

⑶使用轉化方法，將PCR擴增得到的GAL-I-SceI基因序列整合到釀酒酵母基因組上，利用篩選標記基因獲得成功整合的菌株，并設計驗證引物驗證是否構建成功；

⑷含有GAL或其他啟動子所控制表達I-SceI基因的酵母，激活啟動子時，就能夠表達I-SceI內切酶，進而識別兩端預先放置的I-SceI識別位點并進行切割，從而產生雙DSB。

2.根據權利要求1所述的酵母定點雙DSB同步誘導模型的構建方法，其特征在于：所述步驟⑴中上游引物為SEQ NO.1，下游引物為SEQ NO.2；

DNA聚合酶反應體系：ddH₂O 15.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，DNA聚合酶0.5μl，2.5mM的dNTP 1μl，10×Pfubuffer 5μl，DNA模板1μl；

DNA聚合酶程序設定：預變性96℃2min設置1個循環，變性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min設置32個循環，后延伸72℃7min設置1個循環。

3.根據權利要求1所述的酵母定點雙DSB同步誘導模型的構建方法，其特征在于：所述步驟⑵中上游引物為SEQ NO.3，下游引物為SEQ NO.4；

DNA聚合酶反應體系：ddH₂O 15.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，DNA聚合酶0.5μl，2.5mM的dNTP 1μl，10×Pfubuffer 5μl，DNA模板1μl；

DNA聚合酶程序設定：預變性96℃2min設置1個循環，變性94℃30s、退火56℃60s、延伸72℃1500bp/min設置32個循環，后延伸72℃7min設置1個循環。

4.根據權利要求1所述的酵母定點雙DSB同步誘導模型的構建方法，其特征在于：所述步驟⑶中上游引物為SEQ NO.5，下游引物為SEQ NO.6。

5.根據權利要求1所述的酵母定點雙DSB同步誘導模型的構建方法，其特征在于：所述步驟⑴中釀酒酵母誘導型啟動子為半乳糖啟動子GAL、己糖轉運載體或乙醇脫氫酶Ⅱ。

6.根據權利要求1所述的酵母定點雙DSB同步誘導模型的構建方法，其特征在于：所述步驟⑴中能夠根據需要通過重疊延伸PCR引入一段無用序列，從而調節兩個DSB的間隔距離。

7.根據權利要求1至6任一項所述的酵母定點雙DSB同步誘導模型的構建方法，其特征在于：所述步驟⑴中I-SceI基因的表達盒包括半乳糖啟動子、I-SceI內切酶、KanMX/潮霉素/諾爾斯菌素篩選標記。