[發(fā)明專利]一種測量小分子藥物抑制蛋白核酸互作的單分子力學方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011102762.4
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN112255396A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發(fā)明（設計）人: 于仲波;馬康康;王澤瑜;梁琳
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N27/74
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種測量小分子藥物抑制蛋白核酸互作的單分子力學方法。首先，設計和構建基于DNA發(fā)卡結構物的單分子反應器。DNA發(fā)卡結構物的莖干部分包含與蛋白互作的基序，把手部分通過聚合酶鏈式反應進行地高辛和生物素標記。其次，制備與DNA互作的蛋白。再次，將DNA發(fā)卡結構物固定在磁珠和玻璃片之間，在微流控反應池內(nèi)通過單分子力學方法進行DNA解鏈實驗。最后，系統(tǒng)測試小分子藥物濃度對結合了蛋白的DNA的解鏈反應的影響，繪制藥物劑量?響應曲線，計算半數(shù)抑制濃度，評估小分子藥物對蛋白核酸互作的藥效。本發(fā)明屬于生物大分子互作和單分子藥理學領域，為分子生物學研究、藥物開發(fā)和藥理評估開發(fā)了一種直接測量小分子藥物抑制蛋白核酸互作的新方法。

技術領域

本發(fā)明屬于生物大分子互作和單分子藥理學領域，尤其是涉及一種測量小分子藥物抑制蛋白核酸互作的單分子力學方法。

背景技術

氨基酸基序在蛋白的結構和功能中發(fā)揮重要的作用，并且普遍是藥物靶點。譬如，骨髓清除藥物白消安(Busulfan)能夠?qū)⒀趸€原酶蛋白CXXC基序中的半胱氨酸轉(zhuǎn)化成為脫氫丙氨酸和羊毛硫氨酸。再如，蛋白激酶PKCθ通過CXXC基序與CD28相互作用，成為小分子藥物二甲基富馬酸酯(dimethyl fumarate，DMF)的作用靶點。因為越來越多的DMF靶點得以鑒別，譬如，NF-kappaB和GAPDH，DMF能夠治療的疾患也有望能從銀屑病和多發(fā)性硬化癥擴展到腫瘤。事實上，對蛋白靶點中的基序進行選擇性的修飾是目前藥物研發(fā)中流行的方法和策略。

藥物靶點的鑒別和對劑量-響應關系進行量化評估在藥物研發(fā)中至關重要，而且依賴于有效的生物物理方法。特別值得指出的是，檢測方法給出的信號應該穩(wěn)健而且能夠避免人工偽跡。例如，白藜蘆醇曾被報道是sirtuin的激動劑，但是后期發(fā)現(xiàn)這是一個多肽底物上的熒光標記引起的實驗偽跡。也就是說，白藜蘆醇的sirtuin激動活性完全依賴于酶底物上共價修飾的熒光基團。

單分子力學技術，作為一種無標記方法，已經(jīng)在多種藥物干預的蛋白核酸互作研究中證明是一種行之有效的量化分析手段。越來越多的研究顯示基于磁鑷、光鑷和納米孔的技術是研究蛋白核酸互作等藥物靶點的極佳平臺。例如，單分子磁鑷曾經(jīng)揭示了抗癌藥物拓撲替康(Topotecan)阻礙拓撲異構酶I解旋的分子機制。但是，目前依然缺乏穩(wěn)健通用的單分子檢測器來探索藥物干預下的蛋白核酸互作機制。

基于單分子磁鑷和DNA發(fā)卡結構物，本方法發(fā)明了一種單分子檢測器來研究藥物干預下的蛋白核酸互作。這種單分子方法通過對DNA發(fā)卡結構物進行解鏈，測量解鏈時間。因為蛋白結合能使得蛋白核酸復合物更加穩(wěn)定，所以蛋白結合時的解鏈時間就比沒有蛋白時更長。如果一種藥物能夠抑制蛋白核酸復合體的形成，那么藥物干預下的蛋白核酸復合體形成就變少，總體穩(wěn)定性變低，從而導致DNA解鏈時間變短。因為MLL1蛋白CXXC結構域結合CpG，所以本方法就以MLL1 CXXC為例來使用這一單分子檢測器研究蛋白結合DNA的反應。本方法設計了一個CpG DNA發(fā)卡結構物，富含AT的背景序列中等距排布了5個CpG位點。CpG位點之間間距20bp，使得蛋白核酸結合位點信號能夠做到基線分離。本方法發(fā)現(xiàn)外力導致的MLL1 CXXC-CpG復合體解離時間大約需要10毫秒。作為初步的概念驗證實驗，本方法展示如何通過測量解鏈時間來發(fā)現(xiàn)DMF作用于MLL1 CXXC-DNA復合體的劑量-響應關系。本方法發(fā)現(xiàn)，DMF作用于MLL1 CXXC-DNA復合體的半數(shù)抑制濃度IC50大約是1μM。這也是DMF靶向CXXC家族蛋白的第一例研究。本方法顯示基于磁鑷的無標記單分子反應器適用于研究靶向蛋白核酸互作的藥物效用。本方法的單分子反應器有望成為藥物發(fā)現(xiàn)領域的通用方法。而且，至目前為止，基于單分子力學測量小分子藥物抑制蛋白核酸互作的方法未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種測量小分子藥物抑制蛋白核酸互作的單分子力學方法。