[發明專利]一種D-阿洛酮糖-3-差向異構酶固定化酶制備方法

在審

• 申請號: 202011102727.2
• 申請日: 2020-10-15
• 公開（公告）號: CN112210551A
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 秦慧民;路福平;毛淑紅;宋展
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N11/089
• 分類號: C12N11/089;C12N9/90;C12P19/02;C12P19/24
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王顕

本發明提供了一種D?阿洛酮糖?3?差向異構酶固定化酶的制備方法，包括如下步驟：將環氧樹脂置于磷酸鉀緩沖液中，25℃恒溫振蕩處理后用超純水清洗；將D?阿洛酮糖?3?差向異構酶加入磷酸鈉緩沖液，再加入經步驟1處理后的環氧樹脂，25℃恒溫振蕩反應12h；反應產物用PBS清洗后得到D?阿洛酮糖?3?差向異構酶固定化酶。本發明通過環氧樹脂E103與D?阿洛酮糖?3差向異構酶分子結合進行固定化酶制備，不需要使用戊二醛交聯，也不使用任何有毒有害的試劑，制備過程及產品安全無毒害。其次，本發明制備的固定化酶穩定性高，可重復多次使用，在55℃條件下連續反應11批次內固定化酶的酶活性沒有明顯衰減，應用前景廣闊。

技術領域：

本發明屬于酶工程技術領域，具體涉及一種D-阿洛酮糖-3-差向異構酶固定化酶的制備方法。

背景技術：

D-阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成員，是一種新型的低能量的甜味劑。因具有較高的甜度和較低的能量，D-阿洛酮糖被認為是一種理想的甜味劑和蔗糖的有效替代品，可用于開發低熱量食品飲料。同時，D-阿洛酮糖可以發生美拉德反應，有助于提升食品品質，可以完美替代糖的功能。此外，D-阿洛酮糖還具有獨特的生理功能，在臨床醫學領域具有較大的潛在應用價值，例如，D-阿洛酮糖可抑制腸道α-葡糖苷酶活性，防止血糖升高，作為Ⅱ型糖尿病的輔助治療劑；D-阿洛酮糖可減小脂肪合酶活性，抑制腹腔內脂肪堆積，降低血脂，還可預防肥胖；同時，D-阿洛酮糖還對神經具有保護作用。2011年美國FDA批準D-阿洛酮糖為GRAS物質，2019年FDA又宣布將低熱量甜味劑D-阿洛酮糖排除在“添加糖”、“總糖”標簽之外，因此不需要在這兩項類目中計算其添加量，無疑將幫助其在未來進一步拓展市場。

利用生物合成法生產D-阿洛酮糖，是利用微生物所產的特異性酶，專一性地催化底物合成D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖-3-差向異構酶(D-allulose-3-epimerase，DAE)可以催化多種酮糖C3位的差向異構，是生產稀有糖的良好催化劑，可以D-果糖為底物生產附加產值高的D-阿洛酮糖。隨著D-阿洛酮糖市場需求量的日益增加，高效生物催化劑的開發對其工業應用至關重要。然而，D-阿洛酮糖-3-異構酶催化果糖轉化為阿洛酮糖的反應過程中，由于酶無法重復利用從而使得工藝成本較高，且水溶性的酶不易從反應系統中分離出來，不利于控制和自動化生產。因此，開發D-阿洛酮糖3-差向異構酶的固定化技術，增加酶穩定性的同時使酶可以反復多次使用，在降低成本的基礎上可進行D-阿洛酮糖的連續生產，對阿洛酮糖的產業發展具有十分重要的意義。

發明內容：

針對現有技術中存在的問題，本發明提供了一種D-阿洛酮糖-3-差向異構酶固定化酶的制備方法，所述方法實現了D-阿洛酮糖-3-差向異構酶固定化，使D-阿洛酮糖-3-差向異構酶可多次重復利用，降低酶催化反應成本。

為此，本發明技術方案具體如下：

1、將環氧樹脂置于磷酸鉀緩沖液中，25℃恒溫振蕩處理后用超純水清洗；

2、將D-阿洛酮糖-3-差向異構酶加入磷酸鈉緩沖液中，之后再加入適量經步驟1處理后的環氧樹脂，25℃恒溫振蕩反應12h；

3、反應產物用PBS清洗數次，得到以環氧樹脂為載體的D-阿洛酮糖-3-差向異構酶固定化酶。

進一步地，步驟2中所述D-阿洛酮糖-3-差向異構酶是以純酶液的形式加入到反應體系中，純酶液中酶的濃度為5～8mg/ml；經步驟1處理后的環氧樹脂與酶在反應體系中的加量比例為：每20～35mg酶對應加入1g環氧樹脂。

進一步地，步驟1中所述磷酸鉀緩沖液由0.1mol/L的K₂HPO₄和0.1mol/L的KH₂PO₄按體積比15～16:1混合配制而成；步驟1中的25℃恒溫振蕩處理是以150rpm振蕩1h，振蕩處理重復2～3次；步驟2中所述磷酸鈉緩沖液的濃度為2mol/L，pH為6.4。