[發(fā)明專利]一種斑馬魚鐵死亡模型的構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011098946.8
• 申請(qǐng)日: 2020-10-14
• 公開（公告）號(hào): CN112226405A
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王明勇;徐又佳;曹子厚
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州木芮生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/073
• 分類號(hào): C12N5/073
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11369
• 代理人: 楊勝

本案涉及一種斑馬魚鐵死亡模型的構(gòu)建方法，包括斑馬魚的繁殖，利用Erastin溶液或枸櫞酸鐵銨溶液處理斑馬魚進(jìn)行鐵死亡模型的構(gòu)建，使用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)鐵死亡模型進(jìn)行驗(yàn)證，出現(xiàn)細(xì)胞死亡即成功構(gòu)建斑馬魚鐵死亡模型。本發(fā)明首次使用斑馬魚來定義和研究鐵死亡現(xiàn)象，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，鐵死亡誘導(dǎo)劑都能明顯地增加斑馬魚體內(nèi)的ROS產(chǎn)生，誘使細(xì)胞死亡數(shù)目明顯增加，改變了鐵死亡相關(guān)基因的表達(dá)。具有便利、快捷、成功率高，易重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)鐵死亡在個(gè)體水平的定性和定量，使斑馬魚能夠成為便利的模型來研究鐵死亡現(xiàn)象，以及鐵死亡相關(guān)的癌癥、血管、骨質(zhì)疏松、代謝以及其他人類疾病的模型，也能為高通量篩選鐵死亡相關(guān)的藥物提供模型。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)模型構(gòu)建領(lǐng)域，具體涉及一種斑馬魚鐵死亡模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

細(xì)胞死亡是哺乳動(dòng)物的發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持以及疾病發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一。鐵死亡(Ferroptosis)是細(xì)胞死亡的一種方式，在細(xì)胞水平，和小鼠的水平已經(jīng)研究較多。鐵死亡是在谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4，GPX4)調(diào)控下鐵依賴性細(xì)胞程序性死亡。2014年細(xì)胞死亡命名委員會(huì)正式命名，鐵死亡有以下4點(diǎn)特征：細(xì)胞死亡與鐵水平增加有因果關(guān)系，鐵死亡過程需有鐵的參與；脂質(zhì)過氧化物增加和NADPH減少；線粒體有特殊形態(tài)改變；可被親脂抗氧化劑和鐵螯合劑逆轉(zhuǎn)。鐵死亡與多種病理性細(xì)胞死亡相關(guān)，例如一些退行性病例改變就是由于修復(fù)過氧化脂質(zhì)的能力下降導(dǎo)致的細(xì)胞死亡；鐵死亡可能具有腫瘤抑制功能，它可以去除無法獲取關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)因子或受感染以及因環(huán)境改變損傷的細(xì)胞。

斑馬魚是一種熱帶鯉科魚，目前被廣泛應(yīng)用于新藥篩選中。這是因?yàn)榘唏R魚遺傳背景清晰，與人類基因相似度高達(dá)87％，器官病變過程又與人類極為接近。同時(shí)，斑馬魚胚胎發(fā)育是全透明的，加上適當(dāng)?shù)纳匾种铺幚恚梢郧逦赜^察病變過程，并且斑馬魚體型小、實(shí)驗(yàn)周期短，且維護(hù)費(fèi)用低廉，非常適合于高通量實(shí)驗(yàn)。然而斑馬魚作為生物醫(yī)學(xué)研究的第三大模式生物，還沒有關(guān)于鐵死亡的應(yīng)用技術(shù)和方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，本發(fā)明目的在于提供一種成本低、見效快、模型性能穩(wěn)定，適用性廣的斑馬魚鐵死亡模型構(gòu)建方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種斑馬魚鐵死亡模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)斑馬魚的繁殖：將性成熟的斑馬魚按雌雄比＝1:2的比例放入交配魚缸內(nèi)，插上隔板，雌雄斑馬魚分開；隔夜后開燈換水，取出隔板，待30-60分鐘后收集魚卵；收集到的魚卵置于含E3的培養(yǎng)皿中，挑選受精魚卵，將受精魚卵按100枚/盤的密度進(jìn)行分盤，加入胚胎培養(yǎng)液，28℃恒溫孵育5小時(shí)；

2)鐵死亡模型的構(gòu)建：挑選步驟1)中孵育正常的斑馬魚，按10-20條/孔的密度分布于6孔板中，加入E3培養(yǎng)液，28℃恒溫孵育24h；除去E3培養(yǎng)液，將6孔板中的受精卵隨機(jī)分為DMSO陰性對(duì)照組、Erastin處理組和枸櫞酸鐵銨(FAC)處理組，分別向其中加入DMSO、Erastin溶液和FAC溶液，恒溫培養(yǎng)48h；

3)鐵死亡模型的驗(yàn)證：使用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)步驟2)中DMSO陰性對(duì)照組、Erastin處理組和FAC處理組的斑馬魚進(jìn)行活體染色，檢測(cè)到細(xì)胞死亡現(xiàn)象，即得到斑馬魚鐵死亡模型。

進(jìn)一步地，所述Erastin溶液的濃度為20μmol/L，F(xiàn)AC溶液的濃度為200μg/ml。

進(jìn)一步地，所述步驟2)中，恒溫培養(yǎng)的條件為28℃、避光處理。