[發明專利]一種聯合表達載體及其在玉米籽粒表達蝦青素中的應用

有效

• 申請號: 202011093167.9
• 申請日: 2020-10-14
• 公開（公告）號: CN111926036B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 柳小慶;陳茹梅;李素貞;楊文竹;周曉今
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/10;A01H6/46
• 代理公司: 北京誠呈知識產權代理事務所(普通合伙) 11883
• 代理人: 楊凌波

本發明公開了一種聯合表達載體及其在玉米籽粒表達蝦青素中的應用。所述表達載體包括pBDEN?CP?BZ、pBDEN?CP?BZ?LcyEi和pBDEN?CP?CH?LcyEi。本發明將載體中攜帶的功能基因及啟動子轉入玉米，選育的玉米籽粒中蝦青素高達100μg/g玉米籽粒干重，是原報道的7倍左右，且蝦青素均是以高生物活性的反式蝦青素為主，這種富含高品質反式蝦青素的玉米新種質將為填補我國蝦青素需求缺口開辟新的途徑。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種蝦青素表達載體及其應用，并確定蝦青素玉米最佳儲存條件和生物利用的方法。

背景技術

蝦青素是一種類胡蘿卜素，存在于各種藻類、微生物和水生動物中，在高等植物中鮮有報道 (Cunningham and Gantt, 2011)。由于其出色的抗氧化能力和其他生物活性，蝦青素作為一種營養補充劑廣泛的應用于食品、飼料、保健品、藥品和化妝品等產品中。蝦青素在飼料工業中,可用作鮑魚、鱘魚、鮭魚、虹鱒魚、真鯛、甲殼類動物及觀賞魚類、各種禽類和生豬的飼料添加劑。根據體內和體外試驗結果表明，蝦青素對癌癥、高血壓、糖尿病、心血管、胃腸道、肝臟、神經退行性疾病和皮膚病等有潛在的積極影響 (Ambati et al.,2014)。歐盟早已批準將蝦青素作為人類膳食補充劑，并且美國食品和藥物管理局已批準將蝦青素用作動物和魚類飼料中的食物著色劑，我國也在食品和飼料添加劑中大量使用蝦青素。然而，在目前的蝦青素供應中，化學合成的工藝復雜技術難度大、生物活性低且有安全風險；酵母發酵來源的產量和生物活性低且成品中含糖量過高；雨生紅球藻提取也存在技術門檻高、產量不高以及總體成本過高的問題。因此，建立一種高產低成本、生物活性高易操作的蝦青素生產體系具有重要意義。

關于蝦青素的基因工程研究率先在藻類和微生物中進行。在煙草、擬南芥等模式中均有成功進行的案例。玉米中也有一例關于蝦青素基因工程的研究工作，該研究通過基因槍共轉化的方式獲得同時表達Crbkt和BrcrtZ （Brevundimonas sp., strain SD212）的轉基因玉米籽粒積累16.8 μg/g干重的蝦青素 (Farré et al., 2016)，但其存在轉化方式帶來的外源基因碎片化和基因分離的問題以及缺少對種質中的蝦青素特性的評價，而我國在玉米中沒有類似的研究服務于我國的蝦青素市場需求。目前，華南農業大學劉耀光院士團隊在水稻胚乳中成功重構了蝦青素的代謝途徑(Zhu et al., 2018)，其蝦青素含量也只有16.0 μg/g水稻干重，遠不能滿足生產的需要。蝦青素的微生物生產方法雖然能產出高蝦青素含量，但是，生物活性確很低，如Gerhard Sandmann等通過傳統突變和代謝工程結合的辦法，產生了一株蝦青素干重達到9mg/g的菌株，是已知的產量最高的紅發夫酵母。然而，由于紅發夫酵母產生的蝦青素為（3R ,3′R）構型，抗氧化能力較低，限制了其在商業規模上的使用。專利201010150422.9 公開了一種蝦青素生產菌株及其誘變篩選方法與應用，涉及一種微生物菌株及其獲取方法。所述蝦青素生產菌株為紅法夫酵母的誘變菌株N1806-04。以紅法夫酵母為出發菌株，采用酶法制備紅法夫酵母原生質體，再通過NTG誘變及β-紫羅酮篩選等方法進行蝦青素生產菌株的選育，獲得蝦青素生產菌株，連續傳代5次后蝦青素的產量穩定。將該蝦青素生產菌株用發酵罐放大培養，其蝦青素產量和含量分別可達500～600mg/L和5000～6300mg/kg，生物量可達80～110g/L。雖然上述微生物生產的蝦青素含量遠高于轉基因植物種子中的含量，但是，其含有的活性反式蝦青素含量低，且該蝦青素只是細胞中的含量，還要提取出來才能應用于工業生產，提取的過程中蝦青素活性又大量喪失，產率也不見得高于轉基因植物的種子，而轉基因玉米種子無需提取可以直接用于需要蝦青素的飼料，比如高端水產養殖業的三文魚配合飼料，虹鱒魚飼料等，也可用于火烈鳥，家禽和寵物飼料等。另外，轉基因玉米來源的蝦青素沒任何異味，藻類來源的有海腥味，酵母來源的有菌味。

發明內容

本發明的目的是提供一種聯合表達載體，用于在玉米作物中表達，促進其高效表達蝦青素。