[發明專利]轉基因水稻EB7001S-6的RPA檢測引物與探針組合、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202011093156.0
• 申請日: 2020-10-13
• 公開（公告）號: CN112301145A
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 宛煜嵩;孟麗霞
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京知匯林知識產權代理事務所(普通合伙) 11794
• 代理人: 董濤

一種轉基因水稻EB7001S?6的RPA檢測引物與探針組合、試劑盒及檢測方法，根據外源插入DNA序列與水稻基因組的連接區域設計大量RPA引物，從中篩選出一對可快速有效檢測出轉基因水稻EB7001S?6成分的引物及探針組合。以轉基因水稻EB7001S?6基因組DNA為模板，利用該對引物和探針進行RPA擴增及實時熒光檢測，具有速度快、特異性好、靈敏度高的特點。

技術領域

本申請涉及分子生物學技術領域，具體而言，涉及一種轉基因水稻 EB7001S-6的RPA檢測引物與探針組合、試劑盒及檢測方法。

背景技術

轉基因水稻EB7001S-6是中國科學院亞熱帶農業生態研究所研發的抗蟲且耐草銨膦除草劑的轉基因水稻品系，是利用基因工程技術將密碼子優化的的epsps基因和來源于土壤細菌的bar基因導入水稻中而獲得的耐草甘膦及草銨膦除草劑轉基因品系。該品系已進入轉基因生物安全評價生產性試驗階段，具有廣闊的產業化前景。在已報道的對轉基因水稻EB7001S-6檢測方法主要是利用PCR儀在實驗室中進行常規檢測，但基于PCR的轉基因檢測方法需要PCR儀、凝膠成像系統等專業儀器設備，且擴增和產物檢測時間較長(約 3～4h)，難以達到現場快速檢測目的，因此，在實際工作中需要一種更加便捷、準確、且適用于現場操作的轉基因檢測新技術。

重組酶聚合酶等溫擴增技術(RPA)，屬于核酸等溫擴增技術的一種。核酸等溫擴增技術(isothermal nucleic acid amplification technology)是一種新型的擴增技術，恒定溫度條件下即可進行反應，具有簡便、快速、靈敏等優點，并可用于進行現場檢驗。RPA技術模擬了生物體內DNA的復制過程，重組酶蛋白在ATP參與下與單鏈DNA(引物)結合，形成DNA核蛋白微絲。該微絲牽扯周圍的DNA分子，對模板DNA序列進行比對并搜索出與之匹配的序列，在單鏈結合蛋白的幫助下，雙鏈模板DNA解鏈，引物和模板配對形成復制起始所需3’羥基末端，在DNA聚合酶的作用下開始復制延伸，并形成新的DNA。 RPA熒光檢測技術極大的縮短了反應時間。目前尚無利用RPA技術對轉基因水稻EB7001S-6進行品系特異性的鑒定方法。

發明內容

本發明提供了一種轉基因水稻EB7001S-6的RPA檢測引物與探針組合, 該引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發明還提供了一種轉基因水稻EB7001S-6的RPA檢測試劑盒，該試劑盒包括上述的引物和探針組合。

本發明還提供了一種轉基因水稻EB7001S-6的RPA檢測方法，該檢測方法包括如下步驟：

以待測樣品的基因組DNA為模板，利用前述的引物和探針組合進行RPA 擴增并進行熒光檢測，如果得到明顯的擴增曲線，則證明所檢樣品含有轉基因水稻EB7001S-6成分。

進一步的，RPA擴增反應體系為每50μl反應體系中包括正向引物和反向引物各20pmol，探針5pmol，DNA模板50ng。

進一步的，RPA擴增反應體系為每50μl反應體系中還包括，再水化緩沖液29.5μl，280μM醋酸鎂溶液2.5μl，余量為水。

進一步的，RPA擴增程序為39℃反應20分鐘

本發明還提供一種前述的檢測引物與探針組合、檢測試劑盒和/或檢測方法在檢測轉基因水稻EB7001S-6的種子資源中的應用。