[發(fā)明專利]一種基于玻璃材料的核酸一步提取聯(lián)合LAMP原位擴(kuò)增的病原體檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011093010.6
• 申請日: 2020-10-13
• 公開（公告）號: CN112063697B
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 童貽剛;賀育敢;劉文麗;安小平;范華昊;宋立華;劉振東
• 申請（專利權(quán)）人: 北京化工大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 北京太兆天元知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11108
• 代理人: 王宇

本發(fā)明公開了一種基于玻璃材料的核酸一步提取聯(lián)合LAMP原位擴(kuò)增的病原體檢測方法。該檢測方法通過活化玻璃材料表面暴露的硅羥基使得活化后的中性玻璃材料表面鋪展成水膜，在高鹽溶液中硅羥基的負(fù)電性誘使陽離子轉(zhuǎn)移至水分子層中形成正電性鹽橋結(jié)構(gòu)快速捕獲具有負(fù)電性磷酸骨架的病原體核酸；將捕獲核酸后的玻璃材料浸染到核酸擴(kuò)增溶液后進(jìn)行原位LAMP擴(kuò)增并加入酸性顯色劑，若存在病原體，隨擴(kuò)增溶液酸化溶液變色。本發(fā)明的檢測技術(shù)核酸提取速度快，步驟簡單，對檢測環(huán)境要求不高，結(jié)果可靠，靈敏度高，同時可避免傳統(tǒng)檢測可能造成的交叉感染，可用于便捷式或家庭病毒檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于玻璃材料的核酸一步提取聯(lián)合LAMP原位擴(kuò)增的病原體檢測方法，可用于床頭檢測技術(shù)(Point-of-Care?Test,POCT)和用戶自我檢測，在不依賴于其它儀器設(shè)備的前提下可用于任何靶點(diǎn)的核酸檢測。在COVID-19等病毒流行期間，便于病毒核酸快速一步提取，并且基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速簡便可視化檢測。

背景技術(shù)

由往以來，人類的健康問題一直是全球持續(xù)關(guān)注和努力解決的艱巨任務(wù)之一。尤其是近年以來，新發(fā)傳染病的頻頻爆發(fā)給人類造成了極大的影響。不論是直接影響人類的生命健康，亦或是間接影響經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，都給國家和人民造成了極大的損失。為此，積極有效的應(yīng)對新發(fā)傳染病顯得尤為必要。在應(yīng)對傳染病的爆發(fā)過程中，對傳染病病原體的早期篩查和檢測十分重要。越是早期檢測越有利于后期的控制和治療，而快速、方便和準(zhǔn)確的檢測技術(shù)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

病原體核酸檢測主要涉及三個主要過程：(1)核酸提取純化，(2)核酸擴(kuò)增，(3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測。對于核酸提取純化，當(dāng)前市面上有很多成熟的試劑盒商品，主要都是借助裂解液裂解細(xì)胞釋放核酸，如常見的離液鹽鹽酸胍、異硫氰酸胍和碘化鈉等等，以及陰/陽離子表面活性劑Triton-X100、Tween?20、SDS以及NP-40等等。而后再借助硅膠或表面改性的磁珠對核酸進(jìn)行吸附而純化。但是，這些試劑盒往往都操作步驟繁多，十分耗時。因此，需要開發(fā)一種簡便快速的病原體核酸提取純化方法以用于后續(xù)核酸擴(kuò)增和檢測。

當(dāng)前，全球?qū)Σ≡w核酸檢測的通用方法是實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增技術(shù)(RT-PCR)。憑借其靈敏的檢測限和成熟的應(yīng)用使其成為病原體檢測的首選方法，但是其也存在一定的局限。該檢測技術(shù)需要借助昂貴的儀器，專業(yè)的技術(shù)人員，同時對待檢測的病毒核酸純度要求較高，檢測時間長，費(fèi)用高。為此，亟待開發(fā)一種簡便快速的檢測方法。相較于PCR的溫度循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)操作更便捷省時省力，是病原體快速檢測的很好選擇。在眾多的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中，環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)由于其特異性強(qiáng)、靈敏度高、擴(kuò)增速度快、檢測結(jié)果讀取方便、同時有望實(shí)現(xiàn)家庭自檢。這些優(yōu)點(diǎn)使LAMP技術(shù)在病原體核酸檢測方面有極大的應(yīng)用潛力。為此，將核酸一步提取后直接用于LAMP原位擴(kuò)增以此實(shí)現(xiàn)快速便捷的自我檢測，尤其是諸如SARS-CoV-2的檢測。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于玻璃材料的核酸一步提取聯(lián)合LAMP原位擴(kuò)增的病原體檢測方法，尤其是用于諸如具有很強(qiáng)的傳染性和潛在的危險(xiǎn)的SARS-CoV-2類病毒的檢測。

技術(shù)方案如下：

一種基于玻璃材料的核酸一步提取聯(lián)合LAMP原位擴(kuò)增的病原體檢測方法，包括以下步驟：

1)活化玻璃材料表面暴露硅羥基，通過親水作用使得活化后的中性玻璃材料表面鋪展成水膜，在高鹽溶液中硅羥基的負(fù)電性誘使陽離子轉(zhuǎn)移至水分子層中形成正電性鹽橋結(jié)構(gòu)快速捕獲具有負(fù)電性磷酸骨架的病原體核酸；

2)將捕獲病原體核酸后的玻璃材料浸染到核酸擴(kuò)增溶液中進(jìn)行原位LAMP擴(kuò)增并加入酸性顯色劑。

進(jìn)一步的，通過Piranha溶液活化玻璃材料。

進(jìn)一步的，所述酸性顯色劑為苯酚紅顯色劑。

進(jìn)一步的，加入酸性顯色劑后，若溶液變成黃色，則存在病原體。