[發明專利]一種Cas蛋白的用途及靶標核酸分子的檢測方法和試劑盒

在審

• 申請號: 202011092324.4
• 申請日: 2017-07-14
• 公開（公告）號: CN112501254A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 上海吐露港生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 張璐;徐迅

本發明提供了一種Cas蛋白的用途及靶標核酸分子的檢測方法和試劑盒，靶標核酸分子的檢測方法包括向含有待檢靶標核酸分子的反應體系中加入向導RNA、Cas12a、核酸探針，反應完成后對其進行檢測。使用本發明的方法可快速檢測樣品中是否含有靶標核酸序列。通過與核酸擴增技術的結合，該檢測方法的靈敏度可以得到大幅度提高。根據該方法的特點，將其命名為HOLMES(one HOur Low?cost Multiplex Efficient Simple assay)，即一小時、低成本、多通道、高效、簡單的分析方法,該方法可用于快速檢測病原微生物、基因突變和特異靶標DNA等。

本案是申請日為2017年7月14日、申請號為CN201710573752.0、發明名稱 為“一種Cas蛋白的用途及靶標核酸分子的檢測方法和試劑盒”的中國發明專利申 請的分案申請。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種用于靶標核酸分子 檢測的方法。

背景技術

特異性檢測核酸分子(Nucleic acid detection)方法具有重要的應用價 值，例如病原體的檢測，遺傳病檢測等。在病原體檢測方面，由于每種病原體 微生物都有其獨一無二的特征核酸分子序列，因此可以開發出針對特定物種的 核酸分子檢測，也稱為核酸診斷(NADs,nucleic acid diagnostics)，在食品 安全、環境微生物污染檢測，人體病原菌感染等領域具有重要意義(O’Connor and Glynn 2010,Scheler,Glynn et al.2014)。另一個方面是對人或其他 物種的單核苷酸多態性(SNPs,single nucleotide polymorphisms)的檢測。 在基因組水平上去理解遺傳變異和生物學功能之間的關系為現代分子生物學 提供了新視角，而其中SNPs對生物學的功能、進化和疾病等密切相關，因此 SNPs的檢測與分析技術的發展尤為重要。

目前已建立了不少NADs的方法，主要是針對特異性DNA分子的檢測，也 有部分方法針對RNA分子。通常來說，DNA分子非常穩定，因此檢測樣品可來 源于一系列復雜的生物樣本；而RNA則非常容易降解，因此處理時需要非常小 心。在上世紀70年代，建立了限制性內切酶酶切檢測的方法，后來又發展了 Southern、Northern和斑點雜交等方法進行特異性檢測核酸分子檢測。1985 年，當PCR方法成為常規實驗方法后，導致了分子生物學指數級的進步。目前 建立的特異性核酸分子檢測通常需要分為兩步，第一步是目的核酸的擴增，第二步是目的核酸檢測。PCR技術是最先建立也是目前最常用的擴增方法，目前 在PCR方法基礎上，引入了熒光標記的探針，可以實時檢測靶標的擴增情況， 稱為Realtime PCR。Realtime PCR不僅是快速、高靈敏的檢測方法，同時這 種方法也可以進行定量分析。除了PCR的擴增方法，還建立了許多替代方法， 比如ligase chain reaction,branched DNAamplification,NASBA,SDA, transcription-mediated amplification,loop mediatedamplification, rolling circle amplification and TwistAmp^TM等。許多這些替代方法的優 勢在于等溫性，也就是說只需要一個溫度即可以完成反應，而不需要像PCR那 樣的熱循環儀器。核酸檢測的方法除了Realtime PCR可以直接完成擴增和檢 測之外，FISH雜交技術(Fluorescence in situ hybridization)是最常用的檢 測方法，通過標記分子探針，原位與互補的靶標序列雜交。除此之外，目前還 開發了biosensors,nanopores和next-generation sequencing technologies 等檢測方法，但這些方法通常需要昂貴的實驗設備。