[發明專利]一種基于總核酸和宏基因組學構建病原微生物測序文庫的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202011092153.5
• 申請日: 2020-10-13
• 公開（公告）號: CN112226488A
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 林靈;魏利然;宋莉;黃倞;王瑤瑤;李無霜;陳靚靚;孫娜娜;王翔;樓敬偉
• 申請（專利權）人: 上海寶藤生物醫藥科技股份有限公司;上海寶藤醫學檢驗所有限公司;上海張江醫學創新研究院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種基于總核酸和宏基因組學構建病原微生物測序文庫的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)對病原微生物感染的樣本中的DNA和RNA分別進行提取，并對所述RNA進行富集，而后混合所得DNA和RNA得到總核酸，作為待測樣本；

或者，直接提取微生物感染的樣本中的總核酸作為待測樣本；

(2)所述待測樣本中含有病原微生物的DNA和RNA，而后對所述待測樣本中的RNA進行片段化，同時進行一鏈cDNA合成；

(3)所述一鏈cDNA合成結束后，再進行二鏈cDNA合成得到cDNA/DNA復合物；

(4)使用片段化酶將所述cDNA/DNA復合物打斷，并進行末端修復和加尾反應、接頭連接、PCR富集和純化，得到基于總核酸構建的測序文庫。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述病原微生物包括細菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒、衣原體、支原體或寄生蟲中任意一種或至少兩種的組合；

步驟(1)所述病原微生物感染的樣本包括肺泡灌洗液、痰液、腦脊液、胸腔積液或穿刺組織中的任意一種或至少兩種的組合；

步驟(1)中直接提取腦脊液和/或穿刺組織中的總核酸作為待測樣本。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述富集的反應體系中包括Turbo脫氧核糖核酸酶和/或Baseline脫氧核糖核酸酶。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)的反應體系中包含樣本中的DNA、RNA、逆轉錄酶、RNA片段化酶和dNTPs；

所述逆轉錄酶與RNA片段化酶的體積比為1:(5～8)；

所述一鏈cDNA合成的反應條件為：

先在20～30℃下反應5～10min，而后在40～42℃下反應10～15min，再于65～70℃下反應10～20min。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)的反應體系中包含樣本中的DNA、一鏈cDNA、DNA聚合酶和無核酶水；

所述二鏈cDNA合成的反應條件為：

先在20～30℃下反應20～40min，而后在60～65℃下反應10～15min。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述末端修復和加尾反應的反應體系中包括：DNA片段化酶及對應預混緩沖液、末端修復-加A尾酶及對應預混緩沖液、DNA片段化-加A尾酶增強子及增強預混緩沖液；

步驟(4)所述接頭連接的反應溫度為22～26℃，反應時間為10～15min。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述接頭連接的反應體系中，片段化的DNA與接頭的使用量比值為(15～20)ng:1μL；

步驟(4)所述測序文庫的濃度≥2.0ng/μL；

步驟(4)所述測序文庫中DNA片段的長度為220bp～400bp。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中純化核酸使用的方法為磁珠純化法；

所述方法還包括將所述測序文庫進行高通量測序和生物信息學分析的步驟。