[發明專利]適于真核表達的優化的兔源RabPON1基因以及重組表達方法

在審

• 申請號: 202011091292.6
• 申請日: 2020-10-13
• 公開（公告）號: CN112175975A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 龔曉潔;王璋
• 申請（專利權）人: 北京森根比亞生物工程技術有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/16;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發明公開了適于真核表達的優化的兔源RabPON1基因以及重組表達方法。本發明通過對RabPON1、G2E6和G3C9基因進行密碼子優化，得到適應于酵母表達系統的核苷酸序列分別為SEQ ID NO.1?6所示的優化基因，進一步融合強信號分泌因子分泌到上清液中獲得有生物學活性的重組蛋白。本發明實現了哺乳動物來源的PON1在畢赤酵母中的表達，既克服了高等真核表達系統繁瑣昂貴的缺陷，又避免了原核表達系統中蛋白修飾環節缺失所導致的失活問題，因此在畢赤酵母成功表達PON1活性蛋白為PON1的多重生物學功能得以應用和推廣提供了基礎。本發明方法簡單可行，成本投入方面低廉快捷，具有其他表達體系不可替代的優勢。

技術領域

本發明涉及密碼子優化的對氧磷酶1基因(PON1)，尤其涉及兔源RabPON1基因的密碼子優化以及將優化基因在真核表達系統畢赤酵母中進行重組表達，屬于兔源RabPON1基因的優化以及重組表達領域。

背景技術

自上個世紀50年代以來，不斷分離到了源自于哺乳動物血清的對氧磷酶PON1(彭薇,張.,姜曉玲,秦浚川,對氧磷酶基因家族.醫學分子生物學雜志,2007.4(1):p.63-66.)，雖然在動物體內含量低，但發現其具有廣泛的底物譜。最先發現其具有對氧磷水解功能，因此命名為對氧磷酶；而后又陸續檢測到PON1對內酯、芳香酯和有機磷酸酯的降解能力；作用的酯鍵有P-O、P-F、P-CN以及P-S，對有機磷毒劑沙林、環氧沙林、梭曼、塔崩和VX均具有降解作用；PON1也可降解一些有機磷農藥，如對氧磷、毒死碑氧磷、敵匹硫磷等(Draganov,D.I.,et al.,Human paraoxonases(PON1,PON2,and PON3)are lactonases with overlappingand distinct substrate specificities.J Lipid Res,2005.46(6):p.1239-47.Ashani,Y.,et al.,In vitro detoxification of cyclosarin in human blood pre-incubatedex vivo with recombinant serum paraoxonases.Toxicol Lett,2011.206(1):p.24-8.)。PON1作用的最佳底物是乙酸苯酯，屬于芳香酯類別，轉化數每秒可達數百個分子數。而近年來發現PON1對內酯家族成員同型半胱氨酸硫內酯也具有高效的水解作用，對血液中脂蛋白的含量和成分起著調控作用，抑制低密度脂蛋白過氧化過程，保護高密度脂蛋白。PON1的內酯酶功能和脂蛋白調節功能使其在機體疾病預防和發生過程中起著重要的作用(李園園,李.,對氧磷酶的生物學特性及與疾病的關系.現代檢驗醫學雜志,2007.22(3):p.91-94.)。PON1的功能多樣性，并且作用效率高，作為動物體內的一道天然屏障，參與了機體解毒、抗病、抗炎、抗氧化等生物學過程(Mackness,M.and B.Mackness,Human paraoxonase-1(PON1):Gene structure and expression,promiscuous activities and multiplephysiological roles.Gene,2015.567(1):p.12-21.Chambers,J.E.,PON1 multitasks toprotect health.Proc Natl Acad Sci USA,2008.105(35):p.12639-40.)。