[發(fā)明專利]一種在生物體內(nèi)產(chǎn)生新突變的方法及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011089074.9
• 申請(qǐng)日: 2020-10-13
• 公開（公告）號(hào): CN112251419A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜臨建;莫蘇東;王繼堯;李玉才;戚偉;李華榮;陳波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島清原化合物有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/10
• 分類號(hào): C12N9/10;C12N9/00;C12N15/54;C12N15/52;C12N15/82;C12N15/65;C12N5/10;A01H5/00;A01H6/46;A01H6/20
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1.一種在生物體內(nèi)產(chǎn)生新突變的方法，其包括以下步驟：在生物體基因組的特定位置上按先后順序依次產(chǎn)生兩個(gè)以上的DNA斷裂并分別自發(fā)修復(fù)，其中在后的DNA斷裂以在先的DNA斷裂修復(fù)后產(chǎn)生的新序列為基礎(chǔ)產(chǎn)生。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的“DNA斷裂”是通過將具有靶向特性的核酸酶遞送到生物體細(xì)胞內(nèi)與基因組DNA特定位置接觸實(shí)現(xiàn)的。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的“具有靶向特性的核酸酶”為ZFN、TALEN或CRISPR/Cas系統(tǒng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的“特定位置上按先后順序依次產(chǎn)生兩個(gè)以上的DNA斷裂”是指針對(duì)由ZFN或TALEN編輯產(chǎn)生的在先的DNA斷裂修復(fù)事件形成的新序列設(shè)計(jì)新的ZFN或TALEN蛋白，對(duì)該位點(diǎn)再次進(jìn)行切割。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的“特定位置上按先后順序依次產(chǎn)生兩個(gè)以上的DNA斷裂”是指針對(duì)由CRISPR/Cas系統(tǒng)編輯產(chǎn)生的在先的DNA斷裂修復(fù)事件形成的新序列設(shè)計(jì)新的靶向RNA，對(duì)該位點(diǎn)再次進(jìn)行切割。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述“兩個(gè)以上的DNA斷裂”是將不同的靶向核酸酶按先后順序遞送到不同代的受體細(xì)胞中產(chǎn)生的，以完成在先編輯的突變細(xì)胞作為受體接受在后編輯的靶向核酸酶的遞送，進(jìn)行二次編輯產(chǎn)生定點(diǎn)突變。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-3、5任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述“兩個(gè)以上的DNA斷裂”是將不同靶向的靶向核酸酶遞送到同一個(gè)受體細(xì)胞中產(chǎn)生的。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-3、5、7任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述“兩個(gè)以上的DNA斷裂”是由同一種CRISPR/Cas核酸酶與不同的gRNA或sgRNA分別組成RNP復(fù)合體按先后順序切割對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)序列產(chǎn)生。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-3、5、7任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述“兩個(gè)以上的DNA斷裂”是由兩種以上識(shí)別不同PAM序列的CRISPR/Cas核酸酶與對(duì)應(yīng)的gRNA或sgRNA分別組成RNP復(fù)合體按先后順序切割對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)序列產(chǎn)生。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述靶向核酸酶為所有能實(shí)現(xiàn)基因組編輯的CRISPR/Cas核酸酶。

11.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述靶向核酸酶以DNA形式存在。

12.根據(jù)權(quán)利要求7-9任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述靶向核酸酶以mRNA或蛋白形式存在，而非DNA形式。

13.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，將靶向核酸酶遞送到細(xì)胞內(nèi)的方法選自1)PEG介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法；2)脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法；3)電擊轉(zhuǎn)化的方法；4)顯微注射；5)基因槍轟擊；或6)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。

14.一種采用權(quán)利要求1-13任意一項(xiàng)所述方法獲得的新突變。

15.一種具有權(quán)利要求14所述新突變的蛋白或其生物活性片段。

16.一種核酸，其包含編碼權(quán)利要求15所述蛋白或其生物活性片段的核酸序列或者其互補(bǔ)序列。

17.一種核酸，其包含：

(a)編碼靶向RNA的核苷酸序列，其中，

所述RNA至少包含兩個(gè)，前一個(gè)RNA靶向DNA導(dǎo)致其斷裂，后一個(gè)靶向RNA針對(duì)前一次斷裂修復(fù)事件形成的序列再次進(jìn)行切斷。