[發明專利]M細胞靶向性重組乳酸菌疫苗及制備方法與應用

有效

• 申請號: 202011088823.6
• 申請日: 2020-10-13
• 公開（公告）號: CN112190704B
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發明（設計）人: 郭樂;劉昆梅;王淑娥;何萌;李欣;楊華
• 申請（專利權）人: 寧夏醫科大學
• 主分類號: A61K39/106
• 分類號: A61K39/106;A61P31/04;A61P1/04;A61P35/00;C12N1/21;C12N15/74;C12R1/01
• 代理公司: 寧夏合天律師事務所 64103
• 代理人: 曹廣濤

本申請提供了M細胞靶向性重組乳酸菌疫苗及制備方法與應用，屬于生物醫學及生物工程領域。本申請提供的M細胞靶向性重組乳酸菌疫苗LL?plSAM?FVpE，是一種可分泌表達含有核心組件SAM和幽門螺旋桿菌毒力因子多表位肽FVpE的重組抗原SAM?FVpE，并將其展示在菌體表面的重組乳酸菌。重組乳酸菌疫苗LL?plSAM?FVpE不僅具有良好的抗原表面展示性能，而且具有胃腸道M細胞靶向性質，可高效地將重組抗原SAM?FVpE靶向遞送給胃腸道M細胞，誘導胃腸道產生針對幽門螺旋桿菌多種毒力因子的特異性黏膜免疫應答，起到防治幽門螺旋桿菌感染相關性胃病的目的。

技術領域

本申請涉及生物醫學及生物工程領域，具體而言，涉及M細胞靶向性重組乳酸菌疫苗及制備方法與應用。

背景技術

幽門螺旋桿菌（Hp）是胃炎、胃潰瘍和胃癌的重要致病因子，世界感染率超過50%，我國Hp感染率高達58.07%，且呈現明顯的家庭聚集性，形式更加嚴峻。目前，臨床治療Hp感染性胃病的方法主要是多聯抗生素療法，但是面臨著抗生物導致Hp耐藥性、治療后再感染、抗生素破壞腸道微生態平衡、藥物毒副作用和病人依從性差等問題，難以在Hp感染人群中大規模推廣使用，研發有效的Hp疫苗具有很好的應用前景。

口服類疫苗的免疫原性一般較弱，需使用大量抗原多次接種，且免疫應答持續時間較短，容易產生免疫耐受。研制口服類疫苗成功的關鍵在于“設計一種有效的黏膜投遞策略，長期穩定地將抗原投遞給黏膜免疫誘導位點，激發高水平免疫應答”。微皺褶細胞（M細胞）是胃腸道黏膜免疫系統中一種特化的抗原轉運細胞，散布于黏膜上皮細胞間，能將抗原從胃腸腔內轉運到上皮下的淋巴組織，誘導黏膜免疫反應。M細胞是胃腸道黏膜免疫系統的“入口”，其對抗原的攝取是啟動胃腸黏膜免疫應答關鍵的第一步。因此，“抗原能否被M細胞大量攝取”是口服類疫苗免疫成敗的關鍵所在。利用“與M細胞表面受體相結合的M細胞靶向肽”，將抗原靶向遞呈給M細胞，增加其對抗原的攝取和轉運效率，激發高水平黏膜免疫應答，是一種提高口服類疫苗免疫效果的有效策略。

疫苗抗原直接口服給藥，疫苗效果往往甚微，其中主要原因是：胃腸道中存在大量的酸和蛋白水解酶，會破壞疫苗抗原。因此，研究安全有效的黏膜免疫投遞系統是口服類疫苗研究領域的一個熱點。乳酸菌是一群在人體腸道內的常見益生細菌，作為口服類疫苗的黏膜免疫投遞系統，具安全性高等獨特優勢。另外，將抗原展示在乳酸菌表面更符合黏膜疫苗的要求。錨定蛋白是細菌表面展示技術中的核心組件。N-乙酰胞壁質酶（AcmA）是在乳酸菌表面展示系統中常用的一種錨定蛋白。然而，在胞內表達的AcmA往往跨膜轉運活性不強。基于AcmA設計更為有效的乳酸菌細胞表面展示系統，仍是一項亟待研究的工作。

發明內容

本申請的第一方面，公開了M細胞靶向性重組乳酸菌疫苗，M細胞靶向性重組乳酸菌疫苗包括將重組抗原展示到表面的可靶向M細胞的重組乳酸菌；重組抗原包括幽門螺旋桿菌毒力因子多表位肽FVpE，幽門螺旋桿菌毒力因子多表位肽FVpE的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

重組乳酸菌表面展示系統主要是將乳酸菌作為一種工程菌，分泌表達疫苗抗原；疫苗抗原通過與其偶聯的錨定蛋白，展示在乳酸菌表面，稱之為重組乳酸菌疫苗。大量實驗研究報道，多種病原體抗原已成功在乳酸菌中分泌表達并展示在乳酸菌表面，經胃腸道黏膜途徑免疫可激發特異性黏膜免疫應答。

幽門螺旋桿菌關鍵毒力因子主要有尿素酶、細胞毒素相關蛋白A（CagA）、空泡毒素相關蛋白A（VacA）、中性粒細胞激活蛋白NAP等。Hp毒力因子多表位疫苗FVpE主要含有來自Hp關鍵毒力因子（尿素酶、CagA和VacA）的優勢抗原表位或區段和中性粒細胞激活蛋白NAP，研究已證實FVpE具有很好的防治Hp感染的免疫效果。

在實施例中，M細胞靶向性重組乳酸菌疫苗可表達出含有核心組件SAM和幽門螺旋桿菌毒力因子多表位肽FVpE的重組抗原，可刺激M細胞產生針對幽門螺旋桿菌的特異性免疫應答。

在前述的第一方面的一些實施例中，編碼幽門螺旋桿菌毒力因子多表位肽FVpE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。