[發(fā)明專利]一種DNA和RNA雙建庫用于NGS標(biāo)定肺癌靶向用藥和化療用藥基因組的方法及系統(tǒng)

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• 申請日: 2020-10-12
• 公開（公告）號: CN112226496A
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李志強(qiáng);李曉華;陳浩
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥金域醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06;C12Q1/6886
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 53113
• 代理人: 葉春娜

本發(fā)明公開一種DNA和RNA雙建庫用于NGS標(biāo)定肺癌靶向用藥和化療用藥基因組的方法及系統(tǒng)：通過直接對已知突變位點的基因進(jìn)行擴(kuò)增后建庫，并進(jìn)行NGS的測序檢測，再結(jié)合生物信息學(xué)分析確定并驗證突變基因的存在；包括以下步驟：S1：核酸提取，并測定DNA/RNA的濃度；S2：構(gòu)建DNA或RNA文庫；S3：上機(jī)測序：將高通量測序文庫上機(jī)，并運行設(shè)備，進(jìn)行NGS測序；S4：數(shù)據(jù)生物信息學(xué)處理分析：將測序得到的Fastq格式文件上傳至真固生物配套的生信分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行自動分析即可；S5：質(zhì)控。本發(fā)明解決了現(xiàn)有肺癌藥物基因檢測系統(tǒng)只可以針對靶向藥物或者化療藥物的問題，將肺癌化療和靶向藥物基因檢測在一個項目里就解決了，檢測成本低，檢測效率高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因測序技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種DNA和RNA雙建庫用于NGS標(biāo)定肺癌靶向用藥和化療用藥基因組的方法及系統(tǒng)。

背景技術(shù)

腫瘤是一種由多基因發(fā)生改變而導(dǎo)致相關(guān)基因功能障礙的復(fù)雜疾病，多基因改變也是腫瘤發(fā)生發(fā)展的最根本原因。腫瘤患者對各種藥物存在明顯個體差異，也與患者個體腫瘤相關(guān)基因差異表達(dá)和多態(tài)性有關(guān)。腫瘤相關(guān)基因的變異狀態(tài)在腫瘤的診斷、治療、預(yù)后等個性化治療過程中起著非常重要的作用，隨著越來越多的標(biāo)志物被鑒定出來，腫瘤的治療方式將根據(jù)患者特異性的生物標(biāo)志物變得越來越個性化，在實現(xiàn)腫瘤個性化治療的道路上，下一代測序(NGS)技術(shù)發(fā)揮著不可取代的作用，它幫助研究人員和病理學(xué)家實現(xiàn)了從單基因檢測到多基因檢測的完美轉(zhuǎn)換。

藥物安全性是病人從個體化用藥首先受益的領(lǐng)域，惡性腫瘤是目前最需要個體化藥物治療的一類疾病，然而，在腫瘤化療中，無論是療效還是毒副作用，都存在較大的個體差異。通過個體基因多態(tài)性檢測分析，可以為醫(yī)生提供有力的證據(jù)和信息，在實施治療方案時，可選擇對患者最有效的藥物治療方案，不僅提高了療效，還可以降低化療毒副作用。當(dāng)前，即便不是所有的藥物都能實行基因?qū)虻膫€體化治療，基因檢測指導(dǎo)下的安全藥物個體化治療已經(jīng)有顯著臨床應(yīng)用意義。

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。近50年來許多國家都報道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明確，大量資料表明，長期大量吸煙與肺癌的發(fā)生有非常密切的關(guān)系。目前。化學(xué)治療是肺癌的最主要治療手段，90％以上的肺癌患者需要接受化療治療，化療對肺癌的療效無論早期或晚期均較肯定，甚至有約1％的早期小細(xì)胞肺癌通過化療治愈，對非小細(xì)胞肺癌的腫瘤緩解率為40％～50％。通過肺癌藥物基因檢測進(jìn)行靶向藥物治療可明顯提高化療效果、精準(zhǔn)性及藥物安全性，現(xiàn)有肺癌藥物基因檢測系統(tǒng)注重對單一靶向藥物或者是化療藥物基因進(jìn)行檢測，也出現(xiàn)了個別針對基因突變的檢測組合，但主要是針對泛癌種設(shè)計，且局限于檢測點突變等常規(guī)突變，無法檢測基因融合突變和剪接變異所帶來的與疾病相關(guān)的基因變異，檢測效率低，檢測成本高。

本發(fā)明檢測體系是利用PCR擴(kuò)增DNA構(gòu)建DNA文庫，同時利用逆轉(zhuǎn)錄mRNA成互補(bǔ)DNA(cDNA)后再經(jīng)PCR擴(kuò)增融合和不同剪切重組的DNA(RNA文庫構(gòu)建)。上述兩種文庫核酸再采用Illumina平臺對目標(biāo)序列進(jìn)行高通量測序和分析，從而獲得目標(biāo)基因的突變信息。Illumina新一代測序技術(shù)可以高通量、并行對核酸片段進(jìn)行深度測序，測序的技術(shù)原理是采用可逆性末端邊合成邊測序反應(yīng)，首先在DNA片段兩端加上序列已知的通用接頭和信標(biāo)序列構(gòu)建文庫，文庫加載到測序芯片F(xiàn)lowcell上，文庫兩端的已知序列與Flowcell基底上的Oligo序列互補(bǔ)，每條文庫片段都經(jīng)過橋式PCR擴(kuò)增形成一個簇，測序時采用邊合成邊測序反應(yīng)，即在堿基延伸過程中，每個循環(huán)反應(yīng)只能延伸一個正確互補(bǔ)的堿基，根據(jù)不同的熒光信號確認(rèn)堿基種類，保證最終的核酸序列質(zhì)量，經(jīng)過多個循環(huán)后，完整讀取核酸序列。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種DNA和RNA雙建庫用于NGS標(biāo)定肺癌靶向用藥和化療用藥基因組的方法及系統(tǒng)。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：