[發(fā)明專利]一種PIVKA-II抗原表位肽和抗PIVKA-II單克隆抗體及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011085905.5
• 申請日: 2020-10-12
• 公開（公告）號(hào): CN112175925A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 芮兵
• 申請（專利權(quán)）人: 南京佰抗生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/74
• 分類號(hào): C12N9/74;C07K16/40;G01N33/573;G01N33/574
• 代理公司: 連云港聯(lián)創(chuàng)專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32330
• 代理人: 魯超

本發(fā)明公開了一種PIVKA?II抗原表位肽、抗PIVKA?II單克隆抗體及其應(yīng)用，本發(fā)明中的抗原表位肽基于在PIVKA?II N末端特異性序列的基礎(chǔ)上添加了特定親水序列，增強(qiáng)了PIVKA?II抗原決定簇的暴露性。基于上述抗原表位肽，本發(fā)明中的單克隆抗能準(zhǔn)確識(shí)別結(jié)合PIVKA?II，而對(duì)凝血酶原無結(jié)合，具有良好的穩(wěn)定性能，可作為診斷試劑的關(guān)鍵性原材料；本發(fā)明也提供了使用上述單克隆抗體的PIVKA?Ⅱ化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測試劑盒及其制備方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及免疫學(xué)和生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及PIVKA-II抗原表位肽構(gòu)建、抗人PIVKA-Ⅱ單克隆抗體篩選和擴(kuò)大生產(chǎn)及所述抗體在體外診斷試劑盒和的應(yīng)用。

背景技術(shù)

肝癌的定性診斷以血清中腫瘤標(biāo)志物AFP水平為主；但研究表明AFP特異性和靈敏度較低，不建議作為單獨(dú)的診斷指標(biāo)，需要與其他診斷方法聯(lián)合使用以提升診斷的可靠性。

而新的肝癌標(biāo)志物PIVKA-Ⅱ具有較高的診斷特異性，得到了越來越多的關(guān)注。PIVKA-Ⅱ是維生素K缺乏誘導(dǎo)的蛋白-II(Protein ind uced by vitamin Kabsence-II)的英文縮寫，又被稱為異常凝血酶原，是一種與血液凝結(jié)、具有與凝血酶原類似結(jié)構(gòu)的糖蛋白。凝血酶原是一種由622個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，位于氨基末端附近的10個(gè)谷氨酸殘基被γ-羧基化形成γ-羧基谷氨酸(Gla)殘基，但當(dāng)機(jī)體處于肝細(xì)胞損傷、肝功能衰竭、維生素K缺乏、維生素K拮抗或者肝癌發(fā)生時(shí)，相應(yīng)羧基化受到干擾導(dǎo)致10個(gè)谷氨酸殘基部分或全部缺少羧基化，而這種修飾異常蛋白被稱為異常凝血酶原DCP或PIVKA-Ⅱ。

PIVKA-Ⅱ在1984年由Liebeman首次作為腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行了相關(guān)研究。最近幾年P(guān)IVKA-Ⅱ在肝癌診斷檢測領(lǐng)域得到了關(guān)注，《亞太肝病學(xué)會(huì)》、《日本肝病學(xué)會(huì)》指南中推薦將其用于篩查高危人員、輔助肝癌診斷、監(jiān)測治療療效以及預(yù)后和復(fù)發(fā)的預(yù)測。研究發(fā)現(xiàn)，在良性肝病患者如慢性肝炎、酒精性肝病或肝硬化中PIVKA-Ⅱ的N末端羧基化數(shù)量往往多于5個(gè)，而在肝細(xì)胞癌癥患者中相應(yīng)羧基化數(shù)量少于4個(gè)。

由于PIVKA-Ⅱ和正常凝血酶的高度相似性以及羧基化位點(diǎn)的多變性，導(dǎo)致了目前能特異性識(shí)別和高親和力結(jié)合PIVKA-Ⅱ的單克隆抗體非常稀少。目前國內(nèi)外只有少數(shù)幾家公司能提供PIVKA-Ⅱ單克隆抗體，如Fujiebio使用的MU-3和Abbott ARCHITECT使用的3C10兩株抗體。因而開發(fā)性能優(yōu)異的、具有自主產(chǎn)權(quán)的PIVKA-Ⅱ單克隆抗體對(duì)于提升PIVKA-Ⅱ診斷試劑性能、提高檢測可靠性、肝癌早發(fā)現(xiàn)早治療具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中PIVKA-Ⅱ和正常凝血酶的高度相似性以及羧基化位點(diǎn)的多變性，導(dǎo)致了目前能特異性識(shí)別和高親和力結(jié)合PIVKA-Ⅱ的單克隆抗體非常稀少的問題，提供一種高特異性和強(qiáng)親和力的抗人LP-PLA2蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種PIVKA-II抗原表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。該多肽序列基于PIVKA-II第11-26氨基酸序列，所用谷氨酸均未γ-羧基化，且在末端增加了獨(dú)特的8個(gè)氨基酸序列以增加免疫性。利用上述免疫多肽，本發(fā)明提供了一種親和力高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的單克隆抗體，并建立其基于化學(xué)發(fā)光法PIVKA-Ⅱ檢測試劑盒從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其濃度的準(zhǔn)確檢測。

高特異性和強(qiáng)親和力的抗人PIVKA-Ⅱ單克隆抗體PV-Ab1，單克隆抗體PV-Ab1重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。單克隆抗體PV-Ab1為可特異性識(shí)別結(jié)合PIVKA-Ⅱ的氨基末端缺少羧基化修飾表位的單克隆抗體。

3、一種包含有權(quán)利要求2所述的單克隆抗體PV-Ab1的試劑盒。