[發明專利]一種蠟樣芽孢桿菌實時熒光PCR檢測方法及應用

有效

• 申請號: 202011082339.2
• 申請日: 2020-10-12
• 公開（公告）號: CN112592985B
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發明（設計）人: 劉斌;王婧;郭璽;穆會乾
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/085
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發明涉及基于MGB探針的實時熒光PCR反應快速檢測體系對8種蠟樣芽孢桿菌進行檢測。本發明以8種蠟樣芽孢桿菌的wzm基因為靶基因，設計并篩選了針對每一個血清型的Taqman特異性引物及MGB探針，并建立了實時熒光PCR檢測方法。具有對食品中常見致病菌?蠟樣芽孢桿菌全部菌株進行檢測的技術手段。利用本發明提供的方法可以準確、快速、靈敏地對8種蠟樣芽孢桿菌菌株進行分子生物學檢測。

技術領域

本發明屬于細菌檢測方法技術領域，涉及用于蠟樣芽孢桿菌全部8種菌株的實時熒光PCR檢測方法及應用。

背景技術

蠟樣芽孢桿菌是一種兼性厭氧型革蘭氏陽性菌，廣泛存在于土壤﹑水﹑空氣﹑動物腸道中，與人類關系密切。由于蠟樣芽孢桿菌是引起食物中毒的常見細菌，尋找一種方法準確鑒定與檢測此菌對于食品安全有重要意義。

細菌的血清型與致病性密切相關，同一種內不同血清型細菌的致病性往往存在著很大差異。血清學分型自上世紀30年代開始被廣泛使用，至今已有超過80年的歷史，可在種/屬內將細菌進一步分類，是一種重要的細菌鑒定方法，目前，血清學鑒定方法是使用最為普遍的致病菌鑒定和溯源方法。傳統血清學鑒定方法雖被廣泛使用，但仍存在諸多缺陷。主要包括：建立血清學分型系統的工作繁瑣、周期長；血清的生產和質控較為困難；血清學鑒定的實驗過程耗時較長（2-6天）等。

細菌表面多糖抗原主要包括O多糖（O抗原）、普通抗原（CA）、胞外多糖抗原、芽孢、以及莢膜多糖（K抗原）等。基于上述表面多糖抗原的多樣性，細菌可被分為不同的血清型。同一細菌不同血清型的O抗原多樣性，是由于編碼合成O抗原的各種酶的基因的遺傳多樣性決定的，這些基因往往成簇地位于基因組上的固定位點，被稱作O抗原基因簇。

TaqMan-MGB實時熒光PCR（Real-time fluorescence PCR）技術原理是，將標記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復性，適溫延伸的熱循環，并遵守聚合酶鏈反應規律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應體系中，在特定光激發下發出熒光。隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，即可表征檢測樣品的類型和含量。

TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，其 5' 末端攜帶熒光基團，如FAM、TET、VIC、HEX等， 3' 端攜帶淬滅基團，如TAMRA、BHQ等。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq 酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。

TaqMan-MGB 探針是近年來在 TaqMan探針的基礎上改進的一種新技術，它在探針3′ 端增加了MGB分子，這種物質能夠提高探針的退火溫度( Tm值) ，從而使它能夠分辨 1個堿基的差別，完全配對，有熒光信號；只要有一個堿基不匹配，就沒有信號。探針的設計首先為15-30 nt長度，Tm為68-70 ℃。 探針由AuGCT Biotechnology Corporation（中國北京）合成，分別在 5' 和 3' 末端具有6-羧基熒光素（FAM）和小溝結合（MGB）部分。引物的長度約為25 nt ，Tm在55-60 ℃之間。 產生的PCR產物在50-200 bp之間。 引物由Invitrogen（中國上海）合成。 如果正向引物的3'末端距離探針的5' 末端1-20 nt（通常為10 nt或更少），則可能更好。