[發(fā)明專利]一種制備強(qiáng)活性、高表達(dá)量的重組雞α干擾素新工藝

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011078931.5
• 申請(qǐng)日: 2020-10-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112175065A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-01-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳巨清;趙海成
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 石家莊石牧藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C07K14/56
• 分類號(hào): C07K14/56;C12N15/81
• 代理公司: 石家莊領(lǐng)皓專利代理有限公司 13130
• 代理人: 王春麗

1.一種制備強(qiáng)活性、高表達(dá)量的重組雞α干擾素新工藝，其特征在于，包括以下步驟：

S1.構(gòu)建重組雞α干擾素的克隆載體

S11.從雞淋巴細(xì)胞中提取RNA，對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到雞α干擾素的cDNA，用ChIFNα引物對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雞α干擾素基因PCR產(chǎn)物，與質(zhì)粒pJET連接，轉(zhuǎn)化，得到重組質(zhì)粒pJET-ChIFNα；

S12.使用EcoRⅠ和XbaⅠ對(duì)步驟S11得到的重組質(zhì)粒pJET-ChIFNα進(jìn)行雙酶切，得到雞干擾素基因ChIFNαDNA，以ChIFNαDNA為模板，用mChIFNα引物進(jìn)行RCR擴(kuò)增，得到重組雞α干擾素mChIFNαDNA；

S2.構(gòu)建重組雞α干擾素的畢赤酵母表達(dá)載體

用酶切和同源重組方法分別把雞α干擾素基因ChIFNα和mChIFNα插入酵母表達(dá)載體pPICZαC中，在E.coli DH5α菌落擴(kuò)增，得到重組雞α干擾素質(zhì)粒pPICZαC-ChIFNα和pPICZαC-mChIFNα；

S3.重組雞α干擾素的蛋白表達(dá)

把重組質(zhì)粒pPICZαC-ChIFNα通過(guò)電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115菌株，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，得到雞α干擾素重組蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備強(qiáng)活性、高表達(dá)量的重組雞α干擾素新工藝，其特征在于，所述ChIFNα引物為：

ChIFNα上游引物:5’-AGCAGAATTCATGGCTGTGCCTGCAAGC-3’，

ChIFNα下游引物:5’-TAACAAGCTTCTAAGTGCGCGTGTTGCCTGC-3’，

所述mChIFNα引物為：

mChIFNα上游引物：5'-GCT AAA GAA GAA GGG GTA TCT C’TC GAG AAG AGA GAG GCTGAA GCA TGT AAC CAC CTT CGC CCC CAG GAT GCC-3‘，

mChIFNα下游引物：5'-TGA GAT GAG TTT TTG TTC TAG AGT GCG CGT GTT GCC TGTGAG GTT-3'。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備強(qiáng)活性、高表達(dá)量的重組雞α干擾素新工藝，其特征在于，步驟S2具體包括以下步驟：

S21.將畢赤酵母載體pPICZαC轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli DH5α，得到E.coliDH5α-pPICZαC菌落，用AOX1通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，EcoR I、Xba I雙酶切，得到pPICZαC載體，

S22.分別將雞α干擾素基因ChIFNα、mChIFNα與畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαC連接反應(yīng)，得到重組質(zhì)粒pPICZαC-ChIFNα、pPICZαC-mChIFNα；

S23.將重組質(zhì)粒pPICZαC-ChIFNα、pPICZαC-mChIFNα酶切線性化、純化，得到線性化重組雞α干擾素表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC-ChIFNα、pPICZαC-mChIFNα。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種制備強(qiáng)活性、高表達(dá)量的重組雞α干擾素新工藝，其特征在于，步驟S3具體包括以下步驟：

S31.制備感受態(tài)畢赤酵母細(xì)胞，將線性化重組雞α干擾素表達(dá)質(zhì)粒pPICZαC-ChIFNα、pPICZαC-mChIFNα電轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞pichia pastoris GS115，得到畢赤酵母重組子；

S32.對(duì)畢赤酵母重組子進(jìn)行抗性篩選，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，確定Mut表型；

S33.對(duì)畢赤酵母重組子菌落進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，得到雞α干擾素重組蛋白。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備強(qiáng)活性、高表達(dá)量的重組雞α干擾素新工藝，其特征在于，步驟S11中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為在42℃反應(yīng)1h后，在70℃反應(yīng)5～10min，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完后，得到的cDNA在-20℃保存；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為在98℃預(yù)變性10s，在58℃變性15s，在72℃變性10s，連續(xù)35個(gè)循環(huán)后，在72℃延伸10min。