[發明專利]轉g10evo-epsps基因大豆實時熒光定量檢測方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 202011076739.2
• 申請日: 2020-10-10
• 公開（公告）號: CN112359123A
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 陳笑蕓;徐曉麗;紀藝;壽惠霞;王鵬飛;繆青梅;來勇敏;徐俊鋒
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 杭州恒翌專利代理事務所(特殊普通合伙) 33298
• 代理人: 王從友

本申請涉及生物檢測技術領域，尤其涉及轉g10evo?epsps基因大豆實時熒光定量檢測方法及其試劑盒。一種用于轉基因大豆g10evo?epsps基因檢測的特異性引物對及探針，所述引物對包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列為TTACCGTGAGAGGTGGTAGACCT，下游引物序列為GTGGTATCACCCTCAGCGAAG；所述探針序列為5′FAM?ttccttcaccgacgcc?MGB3′。通過該引物對和探針建立的實時熒光定量PCR方法，具有特異性好、準確度高和檢測速度快等優勢，可以很好的應用于轉基因大豆g10evo?epsps基因的定量檢測。

技術領域

本申請涉及生物檢測技術領域，尤其涉及轉g10evo-epsps基因大豆實時熒光定量檢測方法及其試劑盒。

背景技術

大豆是人類生產領域中最重要的農作物之一，也是植物蛋白和植物油的重要來源之一。大豆起源于我國，已有5000多年的栽培歷史。大豆在農業、工業、醫學等方面都有極為重要的用途。大豆營養豐富，種子含有40％蛋白質和20％脂肪，還有豐富的異黃酮、卵磷脂、維生素E、皂素等生理活性物質。轉基因技術作為一項新興的生物技術，為生物新品種的培育提供了新的技術手段。轉基因技術被廣泛應用于大豆育種中，培育出了有重要經濟價值的大豆新品種。轉基因大豆也成為世界上商品化時間最早、推廣應用速度最快的轉基因作物。

草甘膦是一種優秀的廣譜滅生性除草劑，具有除草性能優異、成本低廉、容易降解等優點，栽培抗草甘膦作物可大幅度降低雜草防治成本，因此培育抗草甘膦轉基因作物成為轉基因作物研發的重點。如中國發明專利申請(申請號：CN201110009329.0)公開了高抗草甘膦的g10evo-epsps基因是由杭州瑞豐生物科技有限公司研發、擁有自主知識產權的功能基因，目前已成功導入到玉米、大豆、棉花和水稻等作物中，并在其中穩定地整合和表達。但是，仍需要對轉基因大豆草甘膦抗性外源基因表達量和外源基因插入拷貝數等進行定量檢測分析，才能進一步滿足我國轉基因生物安全監管需求，為轉基因生物新品種培育重大專項的順利實施提供保障和支撐，推動我國農業轉基因研究與應用健康發展。實時熒光PCR是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過擴增曲線對結果進行分析。

發明內容

為了解決上述的技術問題，本申請的目的是提供一種用于轉基因大豆g10evo-epsps基因檢測的特異性引物對及探針，通過該引物對和探針建立的實時熒光定量PCR方法，具有特異性好、準確度高和檢測速度快等優勢，可以很好的應用于轉基因大豆g10evo-epsps基因的定量檢測。

為了實現上述的目的，本申請采用了以下的技術方案：

一種用于轉基因大豆g10evo-epsps基因檢測的特異性引物對及探針，所述引物對包括正向引物和反向引物，其中正向引物序列為TTACCGTGAGAGGTGGTAGACCT，反向引物序列為GTGGTATCACCCTCAGCGAAG；所述探針序列為5′FAM-ttccttcaccgacgcc-MGB3′。

進一步，本申請提供了一種用于轉基因大豆g10evo-epsps基因檢測的實時熒光定量PCR方法，該方法包括如下的步驟：

1)提取含量為100％的轉基因大豆基因組DNA，基因組DNA濃度稀釋成為30.0ng/uL，依次按5倍梯度稀釋配制成了6個含量的標準樣品；每個PCR反應設置3個平行，重復3次實驗；

2)采用所述的引物對及探針進行實時熒光定量PCR擴增檢測，根據標準DNA溶液PCR反應的Ct值和初始模板拷貝數的對數分別繪制g10evo-epsps基因和Lectin基因的標準曲線；

3)待測樣品在相同引物、體系及反應條件下進行實時熒光定量PCR反應，獲得Ct值根據標準曲線可計算得樣品g10evo-epsps基因拷貝數。