[發明專利]一種重組海因消旋酶工程菌及其構建方法和用途

在審

• 申請號: 202011076717.6
• 申請日: 2020-10-10
• 公開（公告）號: CN112175929A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 鈕利喜;楊秀清;呂利華;馬師師
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/70;C12N1/21;C12P41/00;C12P13/08;C12R1/19
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司) 14105
• 代理人: 張福增

一種重組海因消旋酶工程菌及其構建方法和用途，以紅球菌R04基因組DNA為模板，用PCR法擴增了編碼海因消旋酶的基因；對其基因進行克隆、重組表達，獲得一株高活性海因消旋酶基因工程菌；工程菌經發酵后可大量表達高活性重組海因消旋酶；當以D,L?5′?異丙基海因為底物利用生物酶法制備D?纈氨酸時，該工程菌與HC01工程菌共同作用可以將轉化速度提高12.12％，轉化率可達99.0％以上。該工程菌可用于非天然D?氨基酸及其衍生物的生物轉化，加速D?氨基酸的轉化過程，提高D?氨基酸轉化效率。

技術領域

本發明屬于酶蛋白分子工程領域，主要涉及一種含重組海因消旋酶工程菌的構建、表達及其用途。

技術背景

D-氨基酸及其衍生物廣泛應用于醫藥、食品、農藥、化妝品等領域，是合成抗菌和抗病毒藥物、殺蟲劑以及多肽合成的重要中間物。例如：D-纈氨酸可應用于生產新型廣譜抗生素、多肽合成過程的纈氨酸保護劑等。D-纈氨酸殺蟲菊酯能抑制昆蟲酶系統活性，有效地防治棉花、蔬菜等作物的主要害蟲，是一類廣譜的很有發展前景的殺蟲殺螨劑。在醫學科研中，D-纈氨酸是重要的手性藥物原料，如由其參與組入的放線菌D是一種抗腫瘤藥物，還可以用其合成抗糖尿病及其并發癥藥物，還可以用來抑制纖維細胞的生長等。雖然D-纈氨酸應用領域的拓展和市場需求仍在擴大，但D-纈氨酸制備研究仍存在天然菌生物轉化率低，生產工藝限制等問題，利用人為構建工程菌進行高效率轉化，將成為氨基酸研究熱點之一。

目前，D-纈氨酸制備方法有生物酶法、外消旋體優先結晶法及外消旋體化學拆分法等。生物酶催化轉化的關鍵是生物催化劑的制備，它可以是微生物細胞，也可以是從微生物細胞中提取的酶。其優點在于立體選擇性強，反應條件溫和、公害少等，缺點是菌種篩選困難、產物后處理工作量大、酶制劑不易保存等。綜合考慮，生物酶法仍不失為一種極有發展前途的方法。目前D-氨基酸類衍生物如D-纈氨酸的生產方式通常選用微生物海因法，D,L-5′-異丙基海因在富含海因消旋酶、D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的微生物的作用下，得到D-纈氨酸(圖1)。底物5′-異丙基海因，其自發消旋速率遠低于D-海因酶的水解速率，所以海因消旋酶成為整個多酶催化反應的限速酶。因此，對5′-單替代海因消旋的研究已成為由外消旋5′-單替代海因制備D-氨基酸反應動力學中的一個非常重要的組成部分。姚忠等研究了L-海因的消旋過程，對其動力學過程進行了分析表明，L-海因的消旋遵循碳負離子理論，消旋過程符合一級反應動力學過程。目前，關于5′-單替代海因的消旋對制備光學活性氨基酸的影響的文獻報道非常少，海因消旋的部分問題也沒有被完全揭示。因此，對于自發消旋速率較慢的底物，構建表達高活性重組海因消旋酶的工程菌顯得尤為重要。

發明內容

本發明的目的是通過基因工程方法，構建工程菌高效表達海因消旋酶，用于彌補酶法制備D-氨基酸時底物5′-單替代海因消旋速率低于D-海因酶水解速率的缺陷，降低生產成本。

本發明以紅球菌R04(Rhodococcus sp.R04)基因組DNA為模板，用PCR法分離克隆了一種海因消旋酶基因，DNA序列分析表明全長735bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，不含內含子，共編碼244個氨基酸殘基。將此基因在大腸桿菌表達系統中表達，獲得了可以高效表達目的基因的工程菌細胞。

本發明的一種海因消旋酶，它的氨基酸序列為SEQ ID No.1所示的序列。

本發明的一種編碼海因消旋酶的多核苷酸，其核苷酸序列為SEQ ID No.2所示的序列。

本發明利用分子克隆技術，將編碼海因消旋酶多核苷酸直接克隆到表達載體—質粒pMAL-s，該質粒含有tac啟動子，具有氨芐抗性，所構建pMAL-s-hyu2重組質粒，利用氯化鈣法轉化原核細胞—E.coli BL21(DE3)，得到工程菌pMAL-s-hyu2/E.coli BL21(DE3)。該工程菌在乳糖的誘導下獲得可溶性表達，本發明所述海因消旋酶工程菌可用于制備D-氨基酸。