[發明專利]一種鈣激活氯離子通道激活劑的篩選方法及應用

在審

• 申請號: 202011076553.7
• 申請日: 2020-10-10
• 公開（公告）號: CN112176020A
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發明（設計）人: 郝峰;李明光;張麗;鄭鍇;王雙;解宇浩;張嘉琪
• 申請（專利權）人: 吉林醫藥學院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12N15/85;C12N15/65;G01N21/64
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理有限公司 11369
• 代理人: 劉小嬌

本發明公開了一種鈣激活氯離子通道激活劑的篩選方法，包括：分別構建ANO1和YFP?H148Q/I152L的真核表達載體；將所述真核表達載體分別穩定轉染入FRT細胞中，且使所述FRT細胞共表達ANO1和YFP?H148Q/I152L兩種蛋白后，經過多次有限稀釋，獲取FRT細胞克隆模型；將所述FRT細胞克隆模型傳代到黑壁透明底的微孔板中，且使細胞密度為每孔20000個細胞，48h后細胞匯合度達到90％以上；向所述黑壁微孔板中分別加入待測試化合物和碘化鈉PBS后測試所述YFP?H148Q/I152L熒光蛋白的相對熒光強度，當所述相對熒光強度迅速下降時，所述待測試化合物為鈣激活氯離子通道激活劑，持續檢測相對熒光強度一直保持下降為直接作用于鈣激活氯離子通道的激活劑。

技術領域

本發明涉及鈣激活氯離子通道激活劑技術領域，尤其涉及一種鈣激活氯離子通道激活劑的篩選方法及應用。

背景技術

鈣激活氯離子通道(calcium-activated chloride channels，CaCCs)在生理情況下被細胞內鈣離子激活，并可轉運體內含量最豐富的氯離子，CaCCs表達于血管平滑肌細胞、血管內皮細胞、骨骼肌、心肌細胞、心臟成纖維細胞、上皮細胞、某些特定的腫瘤細胞等。在跨上皮細胞液體轉運、平滑肌細胞收縮、感覺傳導、神經和心臟興奮性等生理活動中扮演者重要角色，與惡性腫瘤、高血壓、胃腸道運動紊亂、囊性纖維化和疼痛等許多疾病的發生密切相關。2008年三個獨立實驗室發現Anocatmin1(ANO1)是CaCCs的編碼基因，從而拉開了深入研究CaCCs的序幕。目前比較公認的是，ANO1激活劑可以用于治療囊性纖維化、口干、眼干綜合征和胃腸道動力障礙等CaCCs相關疾病的治療。

目前ANO1激活劑的篩選首先通過細胞模型進行初篩，檢測ANO1是否開放或者激活主要通過鹵族元素敏感的熒光染料或者熒光蛋白，因為熒光染料方法操作步驟繁瑣、價格昂貴且重復性不佳，目前更多傾向于使用鹵族元素敏感的熒光蛋白。在獲得初篩的陽性結果后，通過電生理技術如膜片鉗即研究離子通道的金標準進行確證實驗。申請號為201410078438.1的發明專利中公開了篩選鈣激活氯離子通道抑制劑的細胞模型和方法，通過該模型進行ANO1激活劑的篩選時，由于研究者在篩選ANO1激活劑時，忽視了ANO1的生理特性如在不同情況下的開放時間，特別是在ANO1被高濃度激活劑激活時開放時間明顯縮短且電流大小明顯降低的現象，從而在篩選中一直未能很好的發現真正的ANO1激活劑，對于ANO1激活劑的更具體的篩選也一直未能很好的實現。

電生理技術如膜片鉗是篩選離子通道調節劑的金標準，但目前電生理技術還不能實現短時間內大量篩選調節劑的工作，此外，還有機器昂貴、操作繁瑣且難度較大等缺點。為了在短時間內篩選大量小分子化合物，研究者往往選取細胞模型就行高通量篩選。在此過程中往往選取96甚至384孔板同時篩選多種化合物，且每個孔或者說每個化合物篩選時間大約15秒，如果以96孔板為例，篩選到最后一個化合物已經將近25分鐘，如果應用384孔板時間會更長，因此，這也造成了在篩選中未能發現真正的ANO1激活劑，出現了假陰性的結果。

發明內容

本發明設計開發了一種鈣激活氯離子通道激活劑的篩選方法，本發明的發明目的之一是能夠高效篩選鈣激活氯離子通道激活劑，且解決了由于鈣激活氯離子通道在高濃度激活劑的狀態下開放隨時間明顯減弱甚至檢測不出的問題，同時，當篩選時間超過5分鐘時，出現漏篩或者假陽性的測試結果進而導致篩選不準確的問題。

本發明的發明目的之二是通過對高濃度激活劑倍比稀釋后持續測試，能夠篩選出直接作用于鈣激活氯離子通道的激活劑和非直接作用于鈣激活氯離子通道的激活劑的問題。

本發明還設計開發了制備鈣激活氯離子通道激活劑的應用，用于制備直接作用于鈣激活氯離子通道的激活劑和非直接作用于鈣激活氯離子通道的激活劑。

本發明提供的技術方案為：

一種鈣激活氯離子通道激活劑的篩選方法，包括如下步驟：