[發明專利]一種腈水解酶突變體及其在催化合成2-氯煙酸中的應用

有效

• 申請號: 202011074098.7
• 申請日: 2020-10-09
• 公開（公告）號: CN112063607B
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 鄭仁朝;戴安迪;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/78
• 分類號: C12N9/78;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/12;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 韓聰

本發明公開了一種腈水解酶突變體及其在催化合成2?氯煙酸中的應用，屬于酶工程技術領域。所述腈水解酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，即親本腈水解酶的第167位色氨酸W突變為甘氨酸G。本發明提供的腈水解突變體，消除親本腈水解酶對2?氯煙腈的水合活力，催化過程無副產物2?氯煙酰胺產生，且腈水解活力大幅提高，可專一性催化2?氯煙腈水解合成2?氯煙酸，在酶法工業化合成2?氯煙酸中具有重要潛力。

技術領域

本發明涉及酶工程技術領域，具體涉及一種腈水解酶突變體及其在催化合成2-氯煙酸中的應用。

背景技術

2-氯煙酸，又名2-氯尼古丁酸，是一種重要的氮雜環類精細化工中間體，廣泛用于農藥、醫藥化學品的合成。在農藥領域，2-氯煙酸可用于合成磺酰脲類除草劑煙嘧磺隆、酰胺類除草劑吡氟草胺、酰胺類殺菌劑啶酰菌胺以及三唑硫酮類的系列殺菌活性化合物。在醫藥方面，可用于合成抗生素、心血管疾病治療藥物如抗艾滋病藥奈韋拉平、抗抑郁藥米氮平、消炎藥普拉洛芬、抗炎鎮痛藥尼氟滅酸和煙甲滅酸等。由于2-氯煙酸在農藥和醫藥中的廣泛應用，其市場需求日益增長。

目前，2-氯煙酸的生產方法主要為化學法，包括煙酸氮氧化-氯化-水解法、煙腈氧化-氯化-水解法、3-甲基吡啶氯化-氧化法和烯基醚與氰乙酸乙酯成環法等。然而，這些方法存在反應條件嚴苛、環境污染嚴重、設備要求較高等缺陷。因此，開發清潔、高效的2-氯煙酸生產技術具有重要的工業應用價值。

近年來，生物技術領域的突破性進展使生物催化在化學工業中發揮越來越重要的作用，逐漸成為工業可持續發展最有希望的技術之一。生物催化腈化合物水解與水合具有過程高效、環境友好以及高度化學、區域和立體選擇性等顯著優勢，成為羧酸、酰胺工業合成的重要方法，成功實現了丙烯酰胺、煙酰胺等大宗和精細化學品的工業合成。

腈水解酶能夠催化腈化合物水解生成相應的羧酸和氨，但迄今未報道能夠水解2-氯煙腈生成2-氯煙酸的腈水解酶。研究表明，一些腈水解酶同時具有腈水合活性，催化腈化合物生成相應的酰胺。腈水解酶兼具腈水解與腈水合活性的催化特性為其生物有機合成新功能的開發提供了新視角。

蛋白質分子改造是調控腈水解酶催化特性的有效手段，因此，通過分子改造開發能夠專一性水解2-氯煙腈合成2-氯煙酸的突變體，用于2-氯煙酸的生物有機合成，是本領域技術人員需要解決的問題。

發明內容

本發明的目的是通過蛋白質工程技術對Rhodococcus zopfii來源的腈水解酶進行改造，構建一種能夠專一性水解2-氯煙腈合成2-氯煙酸的突變體，對于實現2-氯煙酸的高效、綠色生產具有重要意義。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明利用易錯PCR技術對來源于R.zopfii的腈水解酶編碼基因(SEQ ID NO.1)進行隨機突變，具體地，首先利用T7引物進行PCR擴增，隨機引入突變，得到腈水解酶突變體核苷酸序列，連接到表達載體pET-28b(+)后導入大腸桿菌宿主，誘導表達后通過高通量篩選獲得腈水合活力降低、腈水解活力提高的突變體，測序分析發現SEQ ID NO.2所示的R.zopfii腈水解酶氨基酸序列的第167位色氨酸發生突變。然后結合定點突變方法，對第167位定點突變，得到腈水合活力消除且腈水解活力進一步提高的突變體，從而獲得能夠高效催化2-氯煙腈合成2-氯煙酸的腈水解酶突變體W167G。

本發明提供了一種腈水解酶的突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，即氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的親本腈水解酶的第167位色氨酸W突變為甘氨酸G。

本發明還提供了編碼所述腈水解酶突變體的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發明還提供了一種包含所述基因的重組質粒。作為優選，原始載體為pET-28b(+)。