[發(fā)明專利]靶向新型冠狀病毒棘突的基因、試劑盒、篩選方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011073334.3
• 申請日: 2020-10-09
• 公開（公告）號: CN112159817B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 康春生;王琳;周俊虎;王琦雪;王蘊非
• 申請（專利權(quán)）人: 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/50
• 分類號: C12N15/50;C12N15/867;C12N9/22;C12N15/113;C07K14/165;C40B40/06;C40B50/06;A61K31/7088;A61P31/14
• 代理公司: 天津市宗欣專利商標代理有限公司 12103
• 代理人: 趙岷

1.一種用于靶向新型冠狀病毒SARS-CoV-2棘突的基因，其特征在于，所述用于靶向新型冠狀病毒SARS-CoV-2棘突的基因的RNA序列為SEQ ID NO：6。

2.一種對抗SARS-CoV-2感染的特異性治療試劑盒，其特征在于，所述對抗SARS-CoV-2感染的特異性治療試劑盒包含權(quán)利要求1所述的基因。

3.一種包含權(quán)利要求1所述基因的crRNA文庫，其特征在于，所述crRNA文庫還包含RNA序列SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：5，以及SEQ ID NO：7~SEQ ID NO：39。

4.如權(quán)利要求3所述的crRNA文庫，其特征在于，所述crRNA文庫基于作為SARS-CoV-2的靶向位點的靶RNA序列，利用疊瓦狀方式構(gòu)建；

所述靶RNA序列的RNA為SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。

5.一種利用權(quán)利要求4所述crRNA文庫中的靶RNA序列編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白包括：

所述SEQ ID NO：45編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO：43；

所述SEQ ID NO：46編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO：44。

6.如權(quán)利要求5所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白通過氨基酸序列比對、蛋白三維結(jié)構(gòu)比對、與受體分子對接，獲得的位于SARS-CoV-2 S上的特異性片段。

7.一種細胞，其轉(zhuǎn)染權(quán)利要求1所述基因用于識別新型冠狀病毒SARS-CoV-2棘突。

8.一種用于靶向新型冠狀病毒SARS-CoV-2棘突的基因篩選方法，其特征在于，所述篩選方法包括：

（1）通過氨基酸序列比對、蛋白三維結(jié)構(gòu)比對、與受體分子對接的生物信息學(xué)方法，獲得到位于SARS-CoV-2 S上的特異性片段，編碼所述特異性片段的RNA 為靶RNA序列；

（2）采用疊瓦狀方式設(shè)計針對所述靶RNA序列構(gòu)建crRNA文庫；

（3）計算構(gòu)建的crRNA文庫中RNA序列SEQ ID NO：1~SEQ ID NO：39不同crRNA的GC含量，篩選出GC含量大于或等于0.5的SEQ ID NO：1~ SEQ ID NO：12 12個crRNA序列；

（4）利用生物信息學(xué)模擬所述12個crRNA不同序列crRNA與靶RNA、Cas13a蛋白的結(jié)合，計算復(fù)合物結(jié)合能，根據(jù)結(jié)合能大小，篩選出結(jié)合穩(wěn)定性最高的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10為計算機篩選出的潛在最佳crRNA候選序列；

（5）Cas13a慢病毒的包裝和crRNA的合成、細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染、在細胞水平crRNA識別并降解S效率的檢測、篩選，獲得SEQ ID NO：6序列在上皮細胞中S的顯著降解；

（6）證實crRNA6針對SARS-CoV-2 S的特異性，檢測Cas13a-crRNA6對細胞內(nèi)SARS-CoV S的RNA水平的影響；

所述步驟（5）、（6）中Cas13a慢病毒的包裝和crRNA的合成包括：

1）S/S’和Cas13a慢病毒的包裝： S/S’和Cas13a慢病毒表達載體分別選用pCDH-EF1和GV341；采用瞬時共轉(zhuǎn)染法，將含有表達S/S’或Cas13a的質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒等轉(zhuǎn)染體系轉(zhuǎn)入HEK293T細胞，使細胞內(nèi)進行慢病毒的包裝；包裝好的慢病毒顆粒分泌到細胞外培養(yǎng)上清中，收集上清獲取慢病毒；

2）crRNA的合成：首先，使用T7側(cè)翼引物，通過PCR生成crRNA的DNA模板；在95℃下加熱5min使反應(yīng)混合物變性，隨后在冰上急冷10 min，并在72℃下孵育30 min來進行引物延伸；然后使用T7 sgRNA MICscriptTM試劑盒將T7 PCR產(chǎn)物進行體外轉(zhuǎn)錄；使用EzOmicsTM RNAQuick Clear試劑盒對轉(zhuǎn)錄的crRNA進行純化；

所述細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染包括：人肝癌細胞HepG2細胞在10％ FBS，和1％青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；人肺泡Ⅱ型上皮AT2細胞在添加10％ FBS，10 ng/ml角質(zhì)形成細胞生長因子KGF和1％青霉素-鏈霉素的DMEM/F-12的培養(yǎng)基中，置于37 ℃和5％CO₂的環(huán)境中生長，每隔1天更換1次培養(yǎng)基；

用Lipofectamine R3000將crRNA轉(zhuǎn)染到細胞中；

所述在細胞水平crRNA識別并降解S效率的檢測包括：

1）qRT-PCR：將細胞在TRIzol試劑中裂解；按照TRIzol：氯仿的體積5：1的比例加入氯仿，震蕩10秒，靜置2 min；12000 g離心15 min，取上清；加入適量異丙醇，混勻后靜置10min；12000 g離心10 min，棄上清；加入適量75 %乙醇，輕輕洗滌沉淀，7500 g離心5 min，棄上清；晾干后加入適量的DEPC H₂O溶解RNA；然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA的合成；用SYBR Green Master Mix試劑在DNA Engine Opticon 2兩色qRT-PCR檢測系統(tǒng)上進行qRT-PCR實驗；所用PCR引物包括：SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42；

2） Western blot實驗：用RIPA緩沖液分別裂解相等數(shù)量的AT2細胞，表達S的AT2細胞，表達S和Cas13a的AT2細胞以及表達S，Cas13a和crRNA-6的AT2細胞；通過BCA測定法測定細胞裂解物的總蛋白濃度；首先將標準品按照0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板的標準品孔中，加PBS稀釋液補足到20 μL；加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加PBS稀釋液稀釋到20 μL；將50體積的BCA試劑A與1體積的BCA試劑B充分混勻配成BCA工作液后，各孔均加入200 μL的BCA工作液，37 ℃放置30 min；在562 nm波長下比色，記錄吸光值，根據(jù)標準曲線計算樣品的蛋白濃度；每個樣品用10％的SDS-PAGE凝膠分離，將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后在5％的BSA中封閉2 h；然后將膜在一抗SARS-CoV-2 S抗體、GAPDH抗體中孵育16小時，用TBST洗滌膜3遍，并在HRP偶聯(lián)的二抗中孵育1 h；在TBST中洗滌3次后，使用增強的化學(xué)發(fā)光法對蛋白條帶進行成像；

3）免疫熒光：在用crRNA-6處理后48小時，將爬片上的AT2細胞用于免疫熒光實驗；首先將細胞玻片固定在4％多聚甲醛中，用0.5％Triton X-100透化，并用5％BSA封閉；將載玻片在一抗SARS-CoV-2 S抗體在4 ℃孵育16小時；用PBS洗滌3次后，將細胞玻片與熒光偶聯(lián)的二抗AlexaFluor 594，在25 ℃下孵育1小時；將載玻片用PBS洗滌3次，然后用帶有DAPI的ProLongTM Gold Antifade封片劑進行封片；拍照；

所述篩選包括：

1）根據(jù)GC含量、結(jié)合能分析的結(jié)果，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：9， SEQ ID NO：10與Cas13a蛋白、病毒RNA形成的復(fù)合物穩(wěn)定性可能較高，即SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：9， SEQ ID NO：10可能是潛在最佳crRNA序列；

2）根據(jù)HepG2細胞和AT2細胞的qRT-PCR結(jié)果：在HepG2細胞，與對照組相比，轉(zhuǎn)染SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，的HepG2細胞的S RNA表達水平降低最為顯著；而在AT2細胞，與對照組相比，轉(zhuǎn)染SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ IDNO：12的AT2細胞的S RNA表達水平降低最為顯著；綜合兩種細胞的結(jié)果，SEQ ID NO：6是靶向S RNA效率最高的crRNA序列；

3）western blot檢測、免疫熒光分析結(jié)果，SEQ ID NO：6在AT2細胞中引起S蛋白水平的顯著降低；

4）通過生物信息學(xué)分析與生物學(xué)實驗相結(jié)合的方式篩選出高效率靶向SARS-CoV-2 SRNA的crRNA序列SEQ ID NO：6，Cas13a-crRNA6復(fù)合物引起人肺泡Ⅱ型上皮細胞中S的顯著降解；

5）qRT-PCR結(jié)果顯示crRNA6的特異性：Cas13a-crRNA6沒有引起人肺泡Ⅱ型上皮細胞中SARS-CoV S的RNA的表達水平的改變。

9.一種如權(quán)利要求1所述用于靶向新型冠狀病毒SARS-CoV-2棘突的基因的crRNA在制備對抗SARS-CoV-2感染的特異性治療藥物上的應(yīng)用。