[發明專利]一種豬流感病毒的檢測引物及其試劑盒

在審

• 申請號: 202011070178.5
• 申請日: 2020-10-10
• 公開（公告）號: CN114317813A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 錢學慶;秦煒;宋成林;賀笑非;吳小虎;胡雄敏;崔丹;楊覲瑜;趙垠瑩;侯雋杰
• 申請（專利權）人: 上海潤達榕嘉生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
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本發明提供了一種豬流感病毒的檢測引物，屬于基因檢測技術領域，所述檢測引物包括擴增豬流感病毒基因的正向引物、反向引物及探針引物，本發明采用數字PCR技術檢測豬流感病毒，設計的引物和探針可以擴展適用于其它數字PCR系統；可檢測出低濃度的豬流感病毒核酸樣本，具有很高的特異性及靈敏度，引物擴增效率高，將極大地提高豬流感病毒的檢出率，為臨床檢測豬流感病毒提供一種可靠方法。

技術領域

本發明涉及基因檢測技術領域，尤其是涉及數字PCR檢測豬流感病毒的引物及其試劑盒。

背景技術

豬流感(Swine influenza，SI)是由豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)引起的豬急性呼吸道傳染病，不僅給養豬業帶來了極大的危害，還嚴重危害人類健康，因此引起全球公共衛生的關注。豬流感病毒(SIV)感染可引起以呼吸道疾病為特征的呼吸道疾病如咳嗽，打噴嚏，流鼻涕，直腸溫度升高，昏昏欲睡，呼吸困難和食欲降低。該病毒對熱、消毒劑敏感，而對干燥和低溫的抵抗力強大。豬流感病毒能夠在多種動物的細胞上增殖，但病毒分離和疫苗生產時，經常采用雞胚接種。病毒具有血凝活性，但不同毒株的抗原性無明顯的區分。由于病毒受到抗體的壓力很大，因此病毒的變異頻繁，其機理涉及分子水平的抗原漂移和抗原轉變。

豬流感病毒屬于正黏病毒科甲型流感病毒屬，病毒粒子多形態。基因組包含八個分節段的負鏈RNA，至少編碼12～13種蛋白。根據病毒表面糖蛋白的不同，甲型流感病毒可以分為 16種HA亞型(H1～H16)以及9種NA亞型(N1～N9)。甲型流感病毒可感染多種宿主，包括禽、豬、以及人等。由于豬的呼吸道上皮細胞中同時具有與禽流感病毒和人流感病毒結合的受體，因此人流感病毒和禽流感病毒均可感染豬。同樣，越來越多的報道表明，SIV也可以反傳給禽和人。自1974年起，全球常有SIV感染人的報道，并導致部分病例死亡。更為重要的是1957 年、1968年以及2009年的流感大流行毒株均推測與豬流感病毒有關。2011年8月起，倍受全球關注的豬流感三源重配H3N2/H1N2亞型變異株在美國13個地區造成318人感染，其中1 人死亡，16人住院治療。

近些年，熒光定量PCR(real time polymerase chain reaction，QPCR)是檢測定量豬流感病毒常使用的技術手段，該技術通過在PCR反應體系中加入熒光標記的探針(如TaqMan)，利用實時積累的熒光信號監測整個擴增過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析，以此來評估PCR的擴增效果。熒光定量PCR主要依賴于校準物制備的標準曲線，進而確定未知樣品的濃度，因此是一種相對定量的方法。該技術存在眾多不足：1.校準品和樣品間背景的差異易影響PCR的效率和測量響應；2.低拷貝數的目標核酸分子不能通過擴增檢測到；3.樣品的PCR擴增效率可能與校準物的擴增效率不同；4.RNA提取時引入RNA溶液的雜質或者 RNA降解影響了PCR動態擴增過程。因此，熒光定量PCR很難達到對低拷貝值豬流感病毒的檢測與絕對定量。

數字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)是一項針對單分子靶標核酸絕對定量的新技術。該技術是將含有DNA模板的PCR溶液稀釋后分布到大量的獨立反應室(如芯片)，液體分子遵從泊松分布，單分子間通過稀釋分離，并且獨自進行PCR擴增，這種樣品的分配可以極大降低本底信號的影響，提高低豐度靶標的擴增靈敏度，最后分析每個擴增產物，通過泊松概率分布公式計算出DNA模板的原始拷貝數而不需要采用參考標準物或者外標。極大提高了檢出率，假陰性檢出水平(單DNA模板出現在反應室而未被檢出)非常低。其具有操作方便、檢測通量高、特異性強、靈敏度高、定量準確等優點。

數字PCR作為核酸定量的新技術，克服了實時熒光定量PCR的一系列缺點，實現了單個核酸分子的絕對定量。避免了熒光定量PCR使用標準曲線對測量結果產生影響等問題。此技術可代替熒光定量PCR應用于豬流感病毒的定量檢測。

發明內容

基于上述技術問題，本發明提供了一組特異性強，擴增效率高的PCR引物及探針，再結合高靈敏度的數字PCR技術，以達到檢測和絕對定量低拷貝值豬流感病毒的目的。