[發明專利]一種降嘌呤和尿酸的益生菌株、組合物及其應用

在審

• 申請號: 202011066042.7
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN114317308A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 劉艷紅;李春艷;陳雅珊;代純;黃荷
• 申請（專利權）人: 寧波倍益嘉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;A23L33/135;A61K35/747;A61P19/06;C12R1/25
• 代理公司: 北京知元同創知識產權代理事務所(普通合伙) 11535
• 代理人: 彭勁松

1.一株植物乳桿菌株(Lactobacillus plantarum)KLpl-3，其特征在于，該菌株已于2020年7月28日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 2020366。

2.一種降低血尿酸的益生菌組合物，其特征在于，所述益生菌組合物的活性成分包含權利要求1所述的植物乳桿菌株KLpl-3。

3.根據權利要求1所述的益生菌組合物，其特征在于，所述益生菌組合物含有植物乳桿菌株KLpl-3的活菌數為1*10⁶～5*10¹²cfu/g組合物。

4.權利要求1所述的植物乳桿菌株KLpl-3或權利要求2或3所述的降低血尿酸的益生菌組合物在制備預防和治療高尿酸血癥和/或痛風的藥物或食品中的應用。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的藥物是供口服的劑型。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述劑型是選自：溶液、懸浮液、乳劑、粉末、錠劑、丸劑、糖漿、口含錠、片劑、口嚼膠、濃漿以及膠囊。

7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的食品，包括普通食品，保健食品，或特殊醫學用途配方食品。

8.一種用于篩選降解嘌呤前體的益生菌的含營養的測定反應體系，其組成為：10-50mM磷酸鹽，質量百分比為0.1-1.0％葡萄糖，0.1-0.75％酵母粉和0.1-0.5％硫酸銨，其余為水，pH6.0-7.5。

9.一種降解嘌呤前體的益生菌的篩選方法，包括如下步驟：

1)在只含嘌呤前體的無營養體系篩選益生菌降解嘌呤前體的能力：

a.在只含嘌呤前體的無營養體系篩選益生菌降核苷和核苷酸的能力：將待篩選菌株活化，接種至MRS培養基中培養，在37℃下兼性厭氧或氧濃度0.5％的嚴格厭氧條件下靜置培養8～20h，離心收集菌體，用100mM，pH7.0磷酸鹽緩沖液洗滌3遍后，調整至OD₆₀₀＝2.7，分別加入含0.7mg/mL的腺苷酸，鳥苷酸，肌苷酸，腺苷，鳥苷和肌苷的20mM，pH6.86磷酸鹽測試緩沖體系中，菌體終濃度為OD₆₀₀＝0.6，37℃孵育反應1h，8000g離心5min，取上清900μl，加入100mM高氯酸溶液100μl終止反應，0.22μm膜過濾，然后用高效液相色譜儀進行檢測；

b.在只含嘌呤前體的無營養體系篩選益生菌降脫氧核苷和脫氧核苷酸的能力：將步驟1)篩選到的優勢益生菌株進一步以脫氧鳥苷，脫氧腺苷及脫氧腺苷酸，脫氧鳥苷酸為底物進行篩選測試，測試條件同步驟a)，然后用高效液相色譜儀進行檢測；

2)在含嘌呤前體的有營養體系篩選益生菌降解嘌呤前體的能力：

a.在含嘌呤前體的有營養體系篩選益生菌降核苷和核苷酸的能力：將步驟1)獲得的候篩菌株調整到OD₆₀₀為2.7，分別加入含0.7mg/mL的腺苷酸、鳥苷酸、肌苷酸、腺苷、鳥苷和肌苷的含營養的測定反應體系中，調整菌體濃度OD₆₀₀＝0.3，反應3h終止反應時，離心取出900μl上清液，加入100μl高氯酸終止液，過0.22μm濾膜后上HPLC檢測嘌呤前體的降解效率；所述含營養的測定反應體系的組成為：20mM磷酸鹽，0.2％葡萄糖，0.25％酵母粉和0.2％硫酸銨，其余為水，pH6.86；

b.在含嘌呤前體的有營養體系篩選益生菌降脫氧核苷和脫氧核苷酸的能力：將步驟1)獲得的候篩菌株調整到OD₆₀₀為2.7，分別加入含0.7mg/mL的脫氧腺苷酸，脫氧鳥苷酸，脫氧腺苷，脫氧鳥苷的含營養的測定反應體系中，調整菌體濃度OD₆₀₀＝0.3，反應3h終止反應時，離心取出900μl上清液，加入100μl高氯酸終止液，過0.22μm濾膜后上HPLC檢測嘌呤前體的降解效率；所述含營養的測定反應體系其組成為：20mM磷酸鹽，0.2％葡萄糖，0.25％酵母粉和0.2％硫酸銨，其余為水，pH6.86。

10.一種降尿酸的益生菌的篩選方法，包括如下步驟：

a.將測試菌株進行活化后，接種至MRS培養基中培養，在37℃下兼性厭氧條件下靜置培養8～20h，離心收集菌體，用100mM，pH7.0磷酸鹽緩沖液洗滌3遍后，調整至OD₆₀₀＝2.7，取10uL點到含尿酸的瓊脂平板上，所述尿酸的瓊脂平板的組成為：尿酸4g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，K₂HPO₄2.0g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，瓊脂1.5％，其余為水，調至pH6.0-6.5，置于氧濃度0.5％的厭氧箱培養3-5天，觀察尿酸降解產生的透明圈，根據透明圈的大小，初步判定尿酸的降解能力；

b.將步驟a)篩選到的有尿酸降解能力的益生菌株進行活化培養，離心收集菌體，然后接入滅菌的含1.0g/L尿酸的MRS培養基，調整OD為1.0，厭氧培養箱靜置培養24h，48h，取培養基離心去除菌體沉淀，取上清液測定剩余尿酸濃度，以確定其尿酸降解能力。