[發(fā)明專利]一種將植物基因組靶點序列中的A突變?yōu)镚的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202011060349.6
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN114317596A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設計）人: 王瑤;楊進孝;徐雯;馮峰;宋偉;李璐
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

1.一種將植物基因組靶點序列中的A突變?yōu)镚的方法，為如下1)或2)：

所述1)包括如下步驟：將SpRYn、腺嘌呤脫氨酶和sgRNA導入植物體內，實現將植物基因組靶點序列中的A突變?yōu)镚；

所述2)包括如下步驟：將SpRYn的編碼基因、腺嘌呤脫氨酶的編碼基因和轉錄sgRNA的DNA分子導入植物體內，使所述SpRYn、所述腺嘌呤脫氨酶和所述sgRNA均得到表達，實現將植物基因組靶點序列中的A突變?yōu)镚；

所述sgRNA靶向靶點序列；

所述靶點序列的PAM序列為NGC或NGA或NGG；N為A、T、C或G。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述SpRYn為A1)或A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白質；

A2)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述腺嘌呤脫氨酶為ecTadA和ecTadA*；

所述ecTadA為C1)或C2)或C3)：

C1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質；

C2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質；

C3)在C1)或C2)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質；

所述ecTadA*為E1)或E2)或E3)：

E1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白質；

E2)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質；

E3)在E1)或E2)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質。

4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述sgRNA為esgRNA；

所述esgRNA如式I所示：所述靶點序列轉錄的RNA-esgRNA骨架(式I)；

所述esgRNA骨架為n1)或n2)或n3)：

n1)將序列1第617-702位中的T替換為U得到的RNA分子；

n2)將n1)所示的RNA分子經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

n3)與n1)或n2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。

5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述SpRYn的編碼基因為b1)或b2)或b3)：

b1)序列表中序列1第4132-8232位所示的cDNA分子或DNA分子；

b2)與b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼權利要求1或2中所述SpRYn的cDNA分子或DNA分子；

b3)在嚴格條件下與b1)或b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權利要求1或2中所述SpRYn的cDNA分子或DNA分子；

所述ecTadA的編碼基因為d1)或d2)或d3)：

d1)序列表中序列1第2944-3441位所示的cDNA分子或DNA分子；

d2)與d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼權利要求1或3中所述ecTadA的cDNA分子或DNA分子；

d3)在嚴格條件下與d1)或d2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權利要求1或3中所述ecTadA的cDNA分子或DNA分子；

所述ecTadA*的編碼基因為f1)或f2)或f3)：

f1)序列表中序列1第3538-4035位所示的cDNA分子或DNA分子；

f2)與f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼權利要求1或3中所述ecTadA*的cDNA分子或DNA分子；

f3)在嚴格條件下與f1)或f2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權利要求1或3中所述ecTadA*的cDNA分子或DNA分子。

6.權利要求1-5任一所述方法在植物基因組堿基替換或植物基因組堿基編輯中的應用。