[發明專利]HIST1H2BC應用于活動性結核鑒別診斷

在審

• 申請號: 202011058666.4
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112143797A
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 金奇;張笑冰;劉立國
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院病原生物學研究所
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;G01N33/68;C12N15/10
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為

1.檢測分子標記物HIST1H2BC表達水平的試劑在制備診斷結核病的試劑盒的應用。

2.檢測HIST1H2BC蛋白水平改變在制備診斷結核病試劑盒的應用。

3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，檢測分子標記物HIST1H2BC表達水平方法為熒光定量PCR法。

4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，檢測分子標記物HIST1H2BC表達水平的試劑制備診斷活動性結核病的試劑盒中的應用。

5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述應用包括用于區分活動性結核病患者、結核潛伏感染以及非活動性肺結核非潛伏感染者。

6.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述結核病為肺結核或肺外結核。

7.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，該試劑盒還包括如下組分：

CD15+細胞富集磁珠及相關試劑；

細胞總RNA提取分離柱及相關試劑；

cDNA合成逆轉錄酶及相關試劑；

HIST1H2BC序列擴增特異性引物；

實時熒光定量PCR相關試劑。

8.HIST1H2BC在制備結核病診斷標記物的產品中的應用。

9.HIST1H2BC在制備診斷結核病的醫療器械中的應用，所述的診斷結核病的醫療器械以HIST1H2BC作為診斷分子標記物。

10.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

1)全血樣本處理

按照商業化試劑實驗說明書操作，吸取0.8ml混勻全血到5ml流式管中，已1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃預冷的分離液，吹吸混勻；加入CD15⁺磁珠并迅速向稀釋好的血液中加入一份磁珠，蓋緊蓋子，將流式管妥善安置在Hula Mixer上，4℃，8rpm旋轉孵育20min，

2)磁性分離

⑴取出孵育好的細胞，瞬時離心，在磁力架上靜置2min，小心吸去上清；

⑵加入1.6ml分離液，輕輕吹勻后轉移至對應2ml蛋白低吸附管，磁力架上靜置2min，吸去上清，

⑶從磁力架上取下，加入1.6ml分離液，輕輕吹勻，磁力架上靜置2min，吸去上清，重復1次，

⑷加入350μl的Buffer RLT裂解細胞，渦旋震蕩1min，4℃放置備用，

3)細胞總RNA提取

采用RNeasy Plus Mini Kit對磁珠分選的中性粒細胞總RNA進行提取，具體操作如下：

⑴配制反應體系1和反應體系2

將細胞裂解液在磁力架上靜置2min，吸取細胞裂解液轉移至gDNA去除柱中，12,000rpm離心30s；

⑵向流穿液中加入350μl 70％乙醇，混勻，轉移700μl至RNeasy Mini柱中，12,000rpm，離心15s，棄去流穿液，

⑶加入700μl Buffer RW1，12,000rpm，離心15s，棄去流穿液，

⑷加入500μl Buffer RPE，12,000rpm，離心15s，棄去流穿液，

⑸加入500μl Buffer RPE，12,000rpm，離心2min，更換新的收集管，開蓋全速離心1min，

⑹將RNeasy Mini柱放入標記好編號的1.5mL的EP管，向柱膜中心加入30μL水，靜置1min，12,000rpm，離心1min，所得RNA冰上放置備用，

4)cDNA的合成

取細胞總RNA，采用SuperScript^TMIV VILO^TMMaster Mix進行反轉錄，得到細胞樣本cDNA，

5)HIST1H2BC基因表達量檢測

利用實施熒光定量PCR反應，對宿主體內目標基因的真實表達情況進行檢測，以上步驟中制備的cDNA為模板，加入特異引物對或內參引物對進行實時定量PCR，獲取各個樣本來源模板中的HIST1H2BC基因及內參基因擴增常數，計算目標基因相對表達量。