[發(fā)明專利]一種CAR-T細胞凍存方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011058269.7
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112120012B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發(fā)明（設計）人: 湛振鍵;齊國光;劉世豪
• 申請（專利權）人: 廣東康盾創(chuàng)新產業(yè)集團股份公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 文小花

本發(fā)明公開一種CAR?T細胞凍存方法，包括以下步驟：(1)泊洛沙姆配置成質量濃度1～2.5％的水溶液；將泊洛沙姆水溶液、DMSO與RPMI?1640培養(yǎng)基混合，得混合培養(yǎng)液；(2)用步驟(1)的混合培養(yǎng)液懸浮CAR?T細胞，細胞在0～2℃預凍15～30min；保溫加入氯化鈉、西蘭花多糖和瓜兒豆蛋白，混合后將細胞懸液轉入?20～?30℃放置30～50min，?50～?60℃放置2～5h，然后液氮凍存。本發(fā)明提供的CAR?T細胞的凍存方法，采用階梯型的凍存模式并同時結合合理的凍存液選擇及凍存液使用方法，使得CAR?T細胞凍存后細胞活率、增殖能力以及清除腫瘤細胞能力等均明顯優(yōu)于常規(guī)的凍存方法。

技術領域

本發(fā)明涉及CAR-T細胞技術領域，具體涉及一種CAR-T細胞凍存方法。

背景技術

CAR-T細胞是將人工設計的外源性嵌合抗原受體(CAR)導入到T細胞內后得到的一種改造過的T細胞，這種T細胞具有特異性地結合腫瘤抗原的能力，經體外規(guī)?；鲋澈?，以適合的劑型回輸至患者體內，即能發(fā)揮識別并清除腫瘤細胞的作用。近年來，CAR-T細胞因在白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等多種疾病中表現出積極且持續(xù)有效的治療效果而成為當今腫瘤治療藥物研究領域中的主要熱點之一。

提取-制備-擴增獲得CAR-T細胞的時間較長，在獲得CAR-T細胞后，容易因治療因素發(fā)生變化導致不能及時使用新鮮制得的CAR-T細胞，因此CAR-T細胞通常會進行凍存。但CAR-T細胞作為一類特殊的免疫細胞，其貯存具有特殊性，不合理的貯藏方式不僅可能導致CAR-T細胞喪失其生物學效應，而且可能對受體產生危害。因此，如何使CAR-T細胞獲得長期有效的保存是值得關注的問題。

發(fā)明內容

鑒于現有技術的不足，本發(fā)明提供一種CAR-T細胞凍存方法。

本發(fā)明方案包括以下方面：

一種CAR-T細胞凍存方法，包括以下步驟：

(1)泊洛沙姆配置成質量濃度1～2.5％的水溶液；將泊洛沙姆水溶液、DMSO與RPMI-1640培養(yǎng)基混合，得混合培養(yǎng)液；

(2)用步驟(1)的混合培養(yǎng)液懸浮CAR-T細胞，細胞在0～2℃預凍15～30min；保溫加入氯化鈉、西蘭花多糖和瓜兒豆蛋白，混合后將細胞懸液轉入-20～-30℃放置30～50min，-50～-60℃放置2～5h，然后液氮凍存。

優(yōu)選的，CAR-T細胞在混合培養(yǎng)液中的密度是10⁶～10⁷個/mL。

優(yōu)選的，所述泊洛沙姆為泊洛沙姆108。

優(yōu)選的，泊洛沙姆水溶液、氯化鈉、西蘭花多糖、瓜兒豆蛋白、DMSO和RPMI-1640培養(yǎng)基的質量比為1～2:1～2:17～25:5～10:5～15：46～71。

另一方面，本發(fā)明提供一種CAR-T細胞凍存液，包括以下質量比的組份：泊洛沙姆水溶液、氯化鈉、西蘭花多糖、瓜兒豆蛋白、DMSO和RPMI-1640培養(yǎng)基的質量比為1～2:1～2:17～25:5～10:5～15：46～71。

優(yōu)選的，所述的CAR-T細胞凍存液包括以下質量比的組份：泊洛沙姆水溶液、氯化鈉、西蘭花多糖、瓜兒豆蛋白、DMSO和RPMI-1640培養(yǎng)基的質量比為1:1:25:10:15:48。

本發(fā)明實施例中所使用的西蘭花多糖是通過以下方法制得的：取西蘭花干燥粉碎脫脂后，按料液比1:30～50mL加水，50～70℃超聲提取1～2h，離心取上清，減壓濃縮至體積減少70～85％，加入體積分數85～90％乙醇醇沉12～14h，抽濾，取固體干燥。