[發(fā)明專利]一種篩選上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物的方法

在審

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• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN112111595A
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱傳龍;李毓雯;徐瑞瑞;蔡金原;胡平平;田安然;寧琴;羅小平;李軍
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省人民醫(yī)院（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院）
• 主分類號: C12Q1/6897
• 分類號: C12Q1/6897;C12Q1/02;C12N15/867;C12N15/67;C12N5/10
• 代理公司: 南京科知維創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 32270
• 代理人: 杜依民

本發(fā)明提出一種篩選上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物的方法，通過以EFTUD2為靶點(diǎn)構(gòu)建上調(diào)EFTUD2基因表達(dá)化合物篩選模型對候選化合物進(jìn)行高通量篩選，為尋找一種或若干種能夠有效上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物提供了途徑，為HBV慢性感染患者尤其臨床IFN?α治療效果欠佳患者提供更多的治療選擇提供了希望。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因領(lǐng)域，具體地說是一種篩選上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物的方法。

背景技術(shù)

干擾素-α（IFN-α）是治療慢性乙型肝炎的有效藥物，其發(fā)揮抗病毒效用的機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞分泌抗病毒蛋白來清除乙型肝炎病毒。然而IFN-α治療有明顯的副作用，其治療適應(yīng)癥也相當(dāng)嚴(yán)格。與此同時(shí)，IFN-α治療依賴于宿主完整健全的免疫系統(tǒng)方能有效發(fā)揮抗病毒作用，因此，IFN-α治療的總體有效率并不高，臨床常有IFN-α治療應(yīng)答不佳的慢性乙型肝炎（CHB）患者。

延伸因子TuGTP結(jié)合蛋白2（EFTUD2）是剪接體的重要組成部分，其功能是參與前體信使RNA（pre-mRNA）的剪接以產(chǎn)生蛋白翻譯的直接模板。臨床檢測到IFN-α治療應(yīng)答不佳的CHB患者其肝組織EFTUD2表達(dá)水平低。EFTUD2蛋白可以通過剪接作用調(diào)節(jié)固有免疫信號通路中關(guān)鍵信號分子RIG-1、MDA5mRNA的生成，從而影響干擾素刺激基因（ISGs）的轉(zhuǎn)錄翻譯水平來抑制HBV復(fù)制。因此，建立一種篩選上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物的方法，以及篩選出能夠上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物，為CHB患者中IFN-α治療效果不佳者提供更多的治療選擇顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明旨在建立一種能夠篩選上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物的方法，并運(yùn)用該方法篩選出能上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物，從而探索新的分子靶向免疫調(diào)節(jié)藥物，為CHB患者中IFN-α治療效果不佳者提供更多的治療選擇。

具體的本發(fā)明提出一種篩選上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物的方法，建立以EFTUD2為靶點(diǎn)的化合物篩選細(xì)胞模型，在該模型上進(jìn)行藥篩，篩選出能夠上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物。

進(jìn)一步的，建立以EFTUD2為靶點(diǎn)的化合物篩選細(xì)胞模型包括如下步驟：

S1獲取啟動(dòng)子序列：在UCSC數(shù)據(jù)庫查詢并提取人EFTUD2基因的基因組序列，用BLAST在線程序比對序列，利用EPD真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫在線軟件預(yù)測目的基因啟動(dòng)子位點(diǎn)，用SequenceRetrievalTool獲得hEFTUD2pro-0.5kb、hEFTUD2pro-1.0kb、hEFTUD2pro-1.5kb、hEFTUD2pro-2.0kb四個(gè)啟動(dòng)子序列；

S2篩選出活性啟動(dòng)子序列：通過全基因合成和高保真PCR法釣取各啟動(dòng)子序列，通過雙酶切將目的序列同源重組進(jìn)psiCHECK-2載體來構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，利用雙熒光素酶系統(tǒng)檢測篩選出活性最強(qiáng)的啟動(dòng)子序列；

S3建立以EFTUD2為靶點(diǎn)的化合物篩選細(xì)胞模型：將活性最強(qiáng)的啟動(dòng)子序列與螢火蟲熒光素酶基因序列構(gòu)建成融合基因，再同源重組進(jìn)LV6載體并包裝成LV6-Epro0.5-LUC慢病毒；LV6-Epro0.5-LUC慢病毒感染HepG2細(xì)胞，通過嘌呤霉素篩選以及有限稀釋法獲得Epro-LUC-HepG2單克隆細(xì)胞株，從而建立Epro-LUC-HepG2細(xì)胞模型；

S4篩選有效上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物：利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測受試化合物的細(xì)胞毒性并算出各化合物IC50值；受試化合物以各自IC50值作為終濃度在Epro-LUC-HepG2細(xì)胞模型上進(jìn)行靶向藥物篩選，通過熒光素酶檢測讀取熒光值并計(jì)算熒光素酶相對熒光強(qiáng)度來篩選出有效上調(diào)EFTUD2表達(dá)的化合物。