[發明專利]一種坦布蘇病毒的qRT-PCR檢測用引物對及其應用

在審

• 申請號: 202011057254.9
• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN112126716A
• 公開（公告）日: 2020-12-25
• 發明（設計）人: 陳濟鐺;王杰煌;張濟培
• 申請（專利權）人: 佛山科學技術學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京八月瓜知識產權代理有限公司 11543
• 代理人: 李斌

本發明提供了一種坦布蘇病毒的qRT?PCR檢測用引物對，所述引物對的核苷酸序列如下：上游引物為TMUV?F:ACTAAAGCCCCAGAACCAC；下游引物為TMUV?R：CTGCGTTACTATTCACCTTC；并將該引物對應用于檢測坦布蘇病毒的試劑盒中，具有較高的特異性，檢出率達75.38％，說明其靈敏度高，且該引物對具有良好擴增效率，擴增效率為110％，R²為0.9906，表明該擴增曲線具有良好的線性關系，最低檢測限為10拷貝。將該引物對應用于用多種水禽坦布蘇病毒進行特異性分析中，能實現定量檢測，本發明中的qRT?PCR檢測的成本較低，適用于臨床大樣本檢測與監測。

技術領域

本發明涉及核酸檢測技術領域，具體而言，涉及一種坦布蘇病毒的qRT-PCR檢測用引物對及其應用。

背景技術

坦布蘇病毒(Tembusu Virus)屬于黃病毒科黃病毒屬病毒，病毒粒子呈球型。病毒核酸為單股正鏈不分節段的RNA，長度約11kb，只有一個長的開放閱讀框，但通過裂解和加工，可形成10個蛋白。坦布蘇病毒于1955年在馬來西亞吉隆坡庫蚊體內首次分離，而從2010年開始，我國鴨群開始爆發TMUV感染，感染鴨群主要表現為蛋鴨產蛋下降，甚至停產；雛鴨生產性能下降等。坦布蘇病毒從江蘇、福建等東南沿海地區，不斷蔓延至全國各地，造成嚴重的經濟損失，已成為危害我國養殖業的重要疾病之一。

目前，坦布蘇病毒實驗室檢測方法大致分為血清學檢測及分子生物學檢測這兩種方法。其中血清學檢測包括有瓊脂擴散試驗、中和試驗、間接免疫熒光等，這些方法存在敏感性低、特異性不高或者操作困難，不適應于臨床快速診斷等缺點。雖探針法qRT-PCR較染料法qRT-PCR特異性更強，但是成本較高，不適用于臨床大樣本的檢測與監測。

綜上，在坦布蘇病毒的檢測領域，仍然存在亟待解決的上述問題。

發明內容

基于此，為了解決現有技術中坦布蘇病毒檢測敏感性低、檢測特異性不高、操作困難以及成本高，不適應于臨床快速診斷的問題，本發明提供了一種坦布蘇病毒的qRT-PCR檢測用引物對及其應用，具體技術方案如下：

一種坦布蘇病毒的qRT-PCR檢測用引物對，所述引物對的核苷酸序列如下：

上游引物為TMUV-F:ACTAAAGCCCCAGAACCAC；

下游引物為TMUV-R：CTGCGTTACTATTCACCTTC。

上述坦布蘇病毒的qRT-PCR檢測用引物對在制備檢測坦布蘇病毒的試劑或試劑盒中的應用。

另外，提供一種坦布蘇病毒的qRT-PCR檢測試劑盒，所述qRT-PCR檢測的試劑盒含有所述的引物對。

進一步地，所述qRT-PCR檢測的試劑盒中還包括：標準質粒和反應試劑。

進一步地，所述標準質粒的制備方法如下：

以坦布蘇病毒的NS5蛋白基因為模板，運用TMUV-F、TMUV-R所示的引物進行qRT-PCR擴增反應，得到擴增產物；將擴增產物經凝膠電泳后進行膠回收純化；將純化后的擴增產物與pMD18-T載體連接，轉化至DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆菌株過夜搖菌擴大培養后，得到標準品重組質粒。

進一步地，所述反應試劑包括RealStar Green Fast Mixture和RNase-free H₂O。

另外，還提供一種坦布蘇病毒的qRT-PCR檢測試劑盒檢測的方法，所述方法包括如下步驟：

建立標準曲線：將標準品重組質粒作為模板，進行qRT-PCR擴增反應，反應結束后，根據qRT-PCR擴增反應物的Ct值和標準品質粒濃度繪制標準曲線；

運用Trizol法提取待檢樣品總RNA并洗脫至無酶水中，備用；