[發明專利]應用iTRAQ技術研究家蠶響應球孢白僵菌感染蛋白質組變化的方法

在審

• 申請號: 202011055945.5
• 申請日: 2020-09-30
• 公開（公告）號: CN112229922A
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 呂丁丁;郭錫杰;楊軍;萬愛軍;盧兵
• 申請（專利權）人: 鎮江市高等專科學校
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72;C12Q1/6851
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 余俊杰

1.應用iTRAQ技術研究家蠶響應球孢白僵菌感染蛋白質組變化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

S1、家蠶試驗材料的獲取及總蛋白的提取；

S2、對步驟S1所得的總蛋白樣品依次進行酶解、肽段標記、肽段分離、LC-MS質譜分析；

S3、對步驟S2所得的質譜鑒定結果進行數據查庫、定量分析，獲取家蠶響應球孢白僵菌感染過程中的所有蛋白質組的變化情況。

2.根據權利要求1所述的應用iTRAQ技術研究家蠶響應球孢白僵菌感染蛋白質組變化的方法，其特征在于，S1中家蠶試驗材料的獲取及總蛋白的提取步驟為：

(1)制備球孢白僵菌孢懸液，并將孢懸液稀釋至分生孢子終濃度為4×10⁶個/mL；

(2)取健康3齡起蠶浸沒于步驟(1)的孢懸液中15s，取出后正常飼養，分別取正常飼養18h、24h、36h、48h的不同時間點的染病家蠶，進行液氮速凍后置于-80℃冰箱保存；

(3)取步驟(2)中不同時間點的染病家蠶100μg，提取染病家蠶總蛋白。

3.根據權利要求2所述的應用iTRAQ技術研究家蠶響應球孢白僵菌感染蛋白質組變化的方法，其特征在于，S1中家蠶試驗材料的獲取及總蛋白的提取步驟具體為：

(1)制備球孢白僵菌孢懸液：將球孢白僵菌分生孢子接種于PDA平板上，25±1℃培養后將孢子及菌絲混合物從平板上刮出，移至無菌的0.05％Tween-20溶液中，反復漩渦震蕩，直至孢子分散，再用裝有無菌棉的針筒過濾，除去菌絲，即得球孢白僵菌孢懸液；取10μL孢懸液到血細胞計數板上，在光學顯微鏡下計數，添加0.01％Tween-20溶液，稀釋孢懸液至分生孢子終濃度為4×10⁶個/mL；

(2)球孢白僵菌感染家蠶及取材：取健康3齡起蠶浸沒于步驟(1)的孢懸液中15s，然后將幼蟲和孢懸液同時倒入鐵砂網中，去除孢懸液，然后正常飼養處理后的幼蟲，分別取正常飼養18h、24h、36h、48h的不同時間點的15頭染病家蠶，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存；同時將剩余的幼蟲正常飼養觀察，及時取出死蠶并置于培養皿中保濕培養，監測死蠶血淋巴中球孢白僵菌的芽生孢子和菌絲情況及蠶尸上的球孢白僵菌生長情況；

(3)提取家蠶總蛋白：稱取不同時間點的混合家蠶樣品各100μg，加入Lysis Buffer 3及終濃度為1mM的PMSF、2mM的EDTA，渦旋振蕩后靜置5分鐘，添加終濃度10mM的DTT；冰浴超聲5分鐘、2sec/3sec，25,000g×4℃離心20分鐘，取上清；上清在56℃水浴條件下加入終濃度10mM DTT處理1小時，恢復至室溫后加入終濃度55mM IAM暗室靜置45分鐘。