[發明專利]用于鑒定植物乳桿菌和戊糖乳桿菌的分子標記、檢測引物和檢測方法

有效

• 申請號: 202011049155.6
• 申請日: 2020-09-29
• 公開（公告）號: CN112143820B
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 張淑紅;黃遠斌;吳清平;張菊梅;楊廣珠;丁郁;薛亮;陳謀通;孫奇凡;葉青華;吳詩;古其會;韋獻虎;張友雄
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;朱聰聰

本發明公開了用于鑒定植物乳桿菌和戊糖乳桿菌的分子標記、檢測引物和檢測方法。鑒定植物乳桿菌和戊糖乳桿菌的特異性分子標記，核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或4所示。本發明運用全基因組比對分析技術篩選了植物乳桿菌和戊糖乳桿菌特異分子檢測新靶標，針對新分子靶標設計引物進行PCR擴增，可特異性鑒定兩種目標菌，目前這些分子標記未見報道。與16S rDNA PCR方法和生理生化方法相比，本發明建立的方法具有更高特異性，且操作簡單，檢測周期短，無需進一步測序，檢測成本降低，特別適合L.plantarum和L.pentosus快速初篩，為食品生產企業和檢測機構提供了重要輔助鑒定方法。

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體涉及鑒定植物乳桿菌和戊糖乳桿菌的分子標記、檢測引物和檢測方法。

背景技術：

在乳桿菌菌屬分類地位上，植物乳桿菌和戊糖乳桿菌同屬植物乳桿菌類群，對革蘭氏陽性和陰性致病菌有較好的抑制作用，通過與病原菌營養競爭，抑制病原菌的生長。此外，植物乳桿菌能通過胃并定植于腸道發揮有益作用，具有調節腸道微生態的組成的作用。食品應用方面，植物乳桿菌是工業發酵食品中的主要乳桿菌種類，被廣泛用于發酵食品的制備，如酸奶、發酵香腸、面包和泡菜等，部分植物乳桿菌可作為生物防腐劑使用。戊糖乳桿菌(L.pentosus)最初被鑒定為植物乳桿菌(L.plantarum)，而后由于分子生物學的發展，利用recA基因序列差異將其重新劃分為L.pentosus。戊糖乳桿菌具有特殊的抗菌和益生性質，在食品發酵和保藏過程中起到了重要的作用，且對人體健康具有促進作用。

乳桿菌屬內許多種形態特征非常相似，傳統生化方法往往無法準確區分。部分菌株16S rDNA基因序列也具有較高同源性(L.plantarum和L.pentosus具有99％的相似性)，不能實現亞型分類。烏日拉嘎等利用16S rRNA基因、pheS和pyr G部分基因序列對10株植物乳桿菌及其近緣種進行了區分，以其管家基因pheS和pyrG部分基因序列作為分子標記，結合NCBI數據庫中近緣種的相應序列構建系統發育樹并與以16S rRNA基因構建的系統發育樹進行比較，結果發現基于16S rRNA基因序列不能區分L.plantarum及其近緣種，pheS和pyr G部基因序列能夠區分植物乳桿菌種及其近緣種，pheS用于植物乳桿菌種內分型比pyrG效果更好。將pheS和pyrG部分基因序列串聯使用，試驗菌株與參考菌株的分類關系更加明晰，聯合基因(pheS-pyrG)可作為16S rRNA基因輔助用于植物乳桿菌種及近緣種快速分類鑒定。部分學者根據植物乳桿菌共有的recA基因序列設計種間特異性引物，結合巢式PCR技術，可將將植物乳桿菌中L.plantarum和L.pentosus區分開來，但需要二次PCR擴增。此外，有學者利用dnaK基因序列比對植物乳桿菌類群進行了分類。

發明內容：

本發明的目的是提供一種用于鑒定植物乳桿菌和戊糖乳桿菌的特異性分子標記。

本發明鑒定植物乳桿菌和戊糖乳桿菌的特異性分子標記，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示.

本發明的第二個目的是提供一種鑒定植物乳桿菌和戊糖乳桿菌的鑒定引物組，是以下7對引物中的一對以上的引物組合：

_01473-Plant10-F：5'-TGCGACTGGCGATCATTTTG-3'

_01473-Plant10-R：5'-CACGATAACGGCCGCAATTT-3'；

_01473-Plant4-F：5'-TCTCGCATACGCGACTGAAA-3'

_01473-Plant4-R：5'-ACCCCGCTCCGAAATAATGG-3'；

pspA_1-plant1-F：5'-CGGCAACTACCTGTTAGCCA-3'